一种多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶的制备方法及其应用与流程

一种多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶的制备方法及其应用
1.技术领域
2.本发明涉及多肽技术领域，具体为一种多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶的制备方法及其应用。


背景技术：

3.多肽是以肽键连接在一起而形成的化合物，在临床药物、保健品等方面有着广泛的应用，将多肽分子与天然高分子物质如壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸等结合，在药物载体、抗菌材料、医疗卫生用品等方面有着广阔的应用前景，如申请号为201610280846.4的中国专利文件《一种共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶及其制备方法》，公开了将海藻酸钠活化后与糠胺、马来酰亚胺封端的聚乙烯醇反应，得到海藻酸钠凝胶，再利用光引发剂在紫外光条件下将抗菌多肽接枝于凝胶中，得到共价接枝抗菌多肽的抗菌凝胶，从而实现抗菌多肽共价接枝到凝胶中，实现长期抗菌能力。
4.海藻酸钠的生物相容性好，廉价易得，广泛应用在抗菌材料、生物医疗等方面，如申请号为201910591877.5的中国专利文件《一种海藻酸钠季铵盐止血抗菌剂及其制备方法和应用》，公开了通过将环氧烷基链季铵盐或卤代烷基季铵盐接枝到海藻酸钠中，得到具有抗菌效果和凝血作用的海藻酸钠材料，可以应用于改性纱布和采血针头等医疗卫生领域。本发明将季铵盐和胶原蛋白多肽接枝到海藻酸钠中，并与壳聚糖进行交联，得到具有抗菌性的多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶材料，应用于生物医疗、健康卫生等领域。


技术实现要素：

5.（一）解决的技术问题本发明提供了一种具有抗菌性的多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶的制备方法及其应用。
6.（二）技术方案一种多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：s1：向n,n-二甲基甲酰胺中加入双叔胺海藻酸钠，搅拌均匀后加入氯乙胺盐酸盐的水溶液，反应后调节溶液ph至中性，加入丙酮进行沉淀，过滤溶剂，依次用丙酮、乙醇洗涤沉淀并干燥，得到双季铵盐海藻酸钠。
7.s2：配置pbs缓冲液，并加入双季铵盐海藻酸钠，搅拌均匀后依次滴加含有胶原蛋白多肽的pbs缓冲液、含有转谷氨酰胺酶的pbs缓冲液，其中转谷氨酰胺酶的用量为胶原蛋白多肽重量的8-13%，反应后加热回流使转谷氨酰胺酶失活，冷却后将产物在透析袋中透析纯化并干燥，得到多肽接枝海藻酸钠。
8.s3：向蒸馏水中加入多肽接枝海藻酸钠，搅拌均匀后滴加含有壳聚糖的醋酸溶液，然后滴加20-35%的戊二醛的水溶液，控制反应温度在60-85 ℃之间，反应时间在3-6 h之
g的氯乙胺盐酸盐的水溶液，控制反应温度为120 ℃，反应时间为24 h，反应后调节溶液ph至中性，加入丙酮进行沉淀，过滤溶剂，依次用丙酮、乙醇洗涤沉淀并干燥，得到双季铵盐海藻酸钠。
24.（3）配置ph为7的pbs缓冲液，并加入3 g的双季铵盐海藻酸钠，搅拌均匀后依次滴加含有2.5 g的胶原蛋白多肽的pbs缓冲液、含有0.22 g的转谷氨酰胺酶的pbs缓冲液，控制反应温度为60 ℃，控制反应时间为6 h，反应后加热回流使转谷氨酰胺酶失活，冷却后将产物在透析袋中透析纯化并干燥，得到多肽接枝海藻酸钠。
25.（4）向蒸馏水中加入10 g的多肽接枝海藻酸钠，搅拌均匀后滴加含有3 g的壳聚糖的醋酸溶液，然后滴加20%的戊二醛的水溶液，控制反应温度在85 ℃之间，反应时间在3 h之间，交联反应后过滤溶剂，蒸馏水洗涤，得到多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶。
26.实施例2（1）向乙醇中加入5 g的含有双醛结构的氧化海藻酸钠，搅拌均匀后加入3.5 g的3-二甲氨基-1-丙胺，在60 ℃中回流反应48 h，然后温度降至30 ℃并滴加含有2 g的硼氢化钠的水溶液，搅拌还原18 h，反应后减压蒸馏除去溶剂，丙酮洗涤沉淀并干燥，得到双叔胺海藻酸钠。
27.（2）向n,n-二甲基甲酰胺中加入5 g的双叔胺海藻酸钠，搅拌均匀后加入含有4.5 g的氯乙胺盐酸盐的水溶液，控制反应温度为80 ℃，反应时间为36 h，反应后调节溶液ph至中性，加入丙酮进行沉淀，过滤溶剂，依次用丙酮、乙醇洗涤沉淀并干燥，得到双季铵盐海藻酸钠。
28.（3）配置ph为6的pbs缓冲液，并加入3 g的双季铵盐海藻酸钠，搅拌均匀后依次滴加含有1.8 g的胶原蛋白多肽的pbs缓冲液、含有0.15 g的转谷氨酰胺酶的pbs缓冲液，控制反应温度为60 ℃，控制反应时间为6 h，反应后加热回流使转谷氨酰胺酶失活，冷却后将产物在透析袋中透析纯化并干燥，得到多肽接枝海藻酸钠。
29.（4）向蒸馏水中加入10 g的多肽接枝海藻酸钠，搅拌均匀后滴加含有4 g的壳聚糖的醋酸溶液，然后滴加25%的戊二醛的水溶液，控制反应温度在85 ℃之间，反应时间在3 h之间，交联反应后过滤溶剂，蒸馏水洗涤，得到多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶。
30.实施例3（1）向乙醇中加入5 g的含有双醛结构的氧化海藻酸钠，搅拌均匀后加入3.5 g的3-二甲氨基-1-丙胺，在60 ℃中回流反应24 h，然后温度降至40 ℃并滴加含有2 g的硼氢化钠的水溶液，搅拌还原18 h，反应后减压蒸馏除去溶剂，丙酮洗涤沉淀并干燥，得到双叔胺海藻酸钠。
31.（2）向n,n-二甲基甲酰胺中加入5 g的双叔胺海藻酸钠，搅拌均匀后加入含有4.5 g的氯乙胺盐酸盐的水溶液，控制反应温度为100 ℃，反应时间为36 h，反应后调节溶液ph至中性，加入丙酮进行沉淀，过滤溶剂，依次用丙酮、乙醇洗涤沉淀并干燥，得到双季铵盐海藻酸钠。
32.（3）配置ph为6的pbs缓冲液，并加入3 g的双季铵盐海藻酸钠，搅拌均匀后依次滴加含有3.6 g的胶原蛋白多肽的pbs缓冲液、含有0.45 g的转谷氨酰胺酶的pbs缓冲液，控制反应温度为40 ℃，控制反应时间为12 h，反应后加热回流使转谷氨酰胺酶失活，冷却后将产物在透析袋中透析纯化并干燥，得到多肽接枝海藻酸钠。
33.（4）向蒸馏水中加入10 g的多肽接枝海藻酸钠，搅拌均匀后滴加含有5 5 g的壳聚糖的醋酸溶液，然后滴加30%的戊二醛的水溶液，控制反应温度在85 ℃之间，反应时间在6 h之间，交联反应后过滤溶剂，蒸馏水洗涤，得到多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶。
34.实施例4（1）向乙醇中加入5 g的含有双醛结构的氧化海藻酸钠，搅拌均匀后加入3 g的3-二甲氨基-1-丙胺，在80 ℃中回流反应36 h，然后温度降至40 ℃并滴加含有2 g的硼氢化钠的水溶液，搅拌还原12 h，反应后减压蒸馏除去溶剂，丙酮洗涤沉淀并干燥，得到双叔胺海藻酸钠。
35.（2）向n,n-二甲基甲酰胺中加入5 g的双叔胺海藻酸钠，搅拌均匀后加入含有3.2 g的氯乙胺盐酸盐的水溶液，控制反应温度为120 ℃，反应时间为24 h，反应后调节溶液ph至中性，加入丙酮进行沉淀，过滤溶剂，依次用丙酮、乙醇洗涤沉淀并干燥，得到双季铵盐海藻酸钠。
36.（3）配置ph为7的pbs缓冲液，并加入3 g的双季铵盐海藻酸钠，搅拌均匀后依次滴加含有3 g的胶原蛋白多肽的pbs缓冲液、含有0.3转谷氨酰胺酶的pbs缓冲液，控制反应温度为50 ℃，控制反应时间为8 h，反应后加热回流使转谷氨酰胺酶失活，冷却后将产物在透析袋中透析纯化并干燥，得到多肽接枝海藻酸钠。
37.（4）向蒸馏水中加入10 g的多肽接枝海藻酸钠，搅拌均匀后滴加含有6g的壳聚糖的醋酸溶液，然后滴加35%的戊二醛的水溶液，控制反应温度在75 ℃之间，反应时间在3 h之间，交联反应后过滤溶剂，蒸馏水洗涤，得到多肽接枝海藻酸钠-壳聚糖凝胶。
38.对比例1（1）向乙醇中加入5 g的含有双醛结构的氧化海藻酸钠，搅拌均匀后加入2.8 g的3-二甲氨基-1-丙胺，在70 ℃中回流反应24 h，然后温度降至40 ℃并滴加含有1.5 g的硼氢化钠的水溶液，搅拌还原18 h，反应后减压蒸馏除去溶剂，丙酮洗涤沉淀并干燥，得到双叔胺海藻酸钠。
39.（2）向蒸馏水中加入10 g的双叔胺海藻酸钠，搅拌均匀后滴加含有3.5 g的壳聚糖的醋酸溶液，然后滴加30%的戊二醛的水溶液，控制反应温度在80 ℃之间，反应时间在4 h之间，交联反应后过滤溶剂，蒸馏水洗涤，得到海藻酸钠-壳聚糖材料。
40.对比例2（1）向乙醇中加入5 g的含有双醛结构的氧化海藻酸钠，搅拌均匀后加入2.5 g的3-二甲氨基-1-丙胺，在80 ℃中回流反应48 h，然后温度降至40 ℃并滴加含有1.3 g的硼氢化钠的水溶液，搅拌还原24 h，反应后减压蒸馏除去溶剂，丙酮洗涤沉淀并干燥，得到双叔胺海藻酸钠。
41.（2）向n,n-二甲基甲酰胺中加入5 g的双叔胺海藻酸钠，搅拌均匀后加入含有2.8 g的氯乙胺盐酸盐的水溶液，控制反应温度为80 ℃，反应时间为36 h，反应后调节溶液ph至中性，加入丙酮进行沉淀，过滤溶剂，依次用丙酮、乙醇洗涤沉淀并干燥，得到双季铵盐海藻酸钠。
42.（3）向蒸馏水中加入10 g的双季铵盐海藻酸钠，搅拌均匀后滴加含有3 g的壳聚糖的醋酸溶液，然后滴加25%的戊二醛的水溶液，控制反应温度在85 ℃之间，反应时间在3 h之间，交联反应后过滤溶剂，蒸馏水洗涤，得到双季铵盐海藻酸钠-壳聚糖材料。
43.称取海藻酸钠-壳聚糖材料加入到蒸馏水中浸泡12 h，然后取出并沥干表面水分，进行称重，计算海藻酸钠-壳聚糖材料的吸水量w。
44.吸水量w=（m
1-m）/m。m1为海藻酸钠-壳聚糖材料吸水前质量，m为海藻酸钠-壳聚糖材料吸水后质量。 m（g）m1（g）w（g/g）实施例1118.117.1实施例2129.928.9实施例3117.016.0实施例4121.220.2对比例1113.112.1对比例2119.618.6
45.抑菌性能测试：分别将各实施例和对比例中的海藻酸钠-壳聚糖材料加入到到牛肉营养肉汤，然后移取0.5 ml的白色念珠菌菌悬液滴加到牛肉营养肉汤，在37℃摇床中分别作用10 min、30 min、60 min，作为实验组；不加海藻酸钠-壳聚糖材料作为空白组。
46.将牛肉膏蛋白胨培养基加入到无菌培养皿中，然后分别移取各实验组、空白组0.1 ml的白色念珠菌的培养液，在37℃恒温培养箱中培养24 h，培养后进行活菌计数，并测定抑菌率q。
47.抑菌率q=（c-c1）/c
×
100%。c为空白组培养后活菌数，c1为实验组培养后活菌数。
48.以上所述具体实施方式和实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。