用于检测多种生殖道微生态菌群的实时荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及微生物检测，具体涉及一种用于检测多种生殖道微生态菌群的实时荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、阴道微生物群与宿主健康的各个方面有关，包括性传播感染的易感性以及妇科癌症和怀孕结果。正常的阴道菌群以各种乳酸杆菌为主。乳酸杆菌通过产生排除和抑制其他微生物的生长和扩张的抗菌分子来保护阴道生态系统。乳酸可维持阴道ph值在3.5-4.5之间，过氧化氢(一种由嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌产生的抗微生物产品，可保护有害微生物)也能抑制通常与非共生状态相关的细菌的生长，如阴道gardnerella,bacteroides spp.，mobiluncus spp.和厌氧球菌。全世界每年有超过1.75亿妇女被诊断患有妇科疾病，在许多情况下导致高发病率和死亡率。从全球角度看阴道微生物组是妇女公共卫生的一个基本问题，即更好地了解其组成有助于改进对患者的诊断和治疗管理。

2、历史上，阴道菌群首先是通过光学显微镜和培养方法研究的。然而，这些培养方法很难鉴定出严格厌氧和未培养的细菌的数量。基于16s rrna的ngs技术的进展使得对多个样本进行大规模并行分析和极高的通量，并可用于确定细菌类群及其在感兴趣环境样本中的丰度。以序列为基础的方法研究微生物群系，如16s rrna基因测序和宏基因组学，正在揭示微生物类群和无数因素之间的联系。这些方法的一个缺点是，必要的测序文库制备和生物信息学分析是复杂的，并不断变化，这可能是领域的新研究人员的一个障碍。然而，其他研究使用了其他分子方法，如定量pcr(qpcr)和荧光原位杂交(fish)，从而可以识别和量化细菌细胞的数量。因此，这些分子方法拓宽了我们对阴道菌群复杂性的认识。

3、阴道炎是女性求医的一个常见原因，它的准确诊断是关键的适当治疗和防止复发。三种最常见的病因是细菌性阴道病、外阴阴道念珠菌病和滴虫病。在临床实践中，细菌性阴道病的诊断通常是基于经验阴道症状和ph值测试，有时结合在显微镜下阴道涂片湿贴的视觉评估。已经开发了诸如amsel标准和nugent评分等系统来协助这种评估，但它们的分辨率和吞吐量都很低。然而，许多关键的形态很难与外观相似的非贡献生物区分开来，对幻灯片的解释难免有些主观。此外，定量革兰氏染色检查对于常规临床应用是费力和不切实际的，在10-25％的检测样本中报告了不确定临床意义的中间评分。外阴阴道假丝酵母菌病的标准包括湿式培养基上的出芽酵母或假菌丝或阳性培养，临床结果是否一致。滴虫病可通过湿架观察或培养观察，也可通过生化检测、抗原、核酸杂交或核酸扩增法进行诊断。改进生物工具的使用可以更好地识别阴道微生物群及其与疾病的关系。

技术实现思路

1、鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于同步检测多种生殖道微生态菌群的实时荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法。本发明分析了放线菌actinobacteriota、拟杆菌属bacteroides、梭杆菌门fusobacteria、乳杆菌属lactobacillus、链球菌属streptococcus、肠球菌属enterococcus、气球菌属aerococcus、葡萄球菌属staphylococcus、孪生菌属gemella、韦荣氏菌科veillonellaceae、支原体科mycoplasmataceae、梭状芽孢杆菌clostridia、衣原体科chlamydiaceae、肠杆菌科enterobacteriaceae、阴道毛滴虫trichomonas_vaginalis和真菌fungi16种保护菌的基因组信息与特性，最终选择了16s rrna保守区域，并在这些保守区域中设计出针对检测生殖道微生态菌群的特异性引物和探针序列。通过大量的筛选和优化，最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合序列，建立了一种实时荧光定量pcr(real-time pcr)方法，以取代16s rrna基因测序技术来表征阴道微生物。本发明提供的试剂盒和qpcr检测结果与16s测序结果具有良好的相关性，对微生物的存在具有较高的灵敏度。重要的是，试剂盒设计的通道可以准确地确定不同的阴道样本。本发明提供的试剂盒及检测方法可作为宏基因组测序的替代方法，合理设计表达阴道菌群的靶点和引物可以很好地代表阴道菌群。由于其性价比优势，可以为临床快速检测提供强有力的检测手段。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

3、用于检测多种生殖道微生态菌群的检测组合物，所述检测组合物包含检测放线菌actinobacteriota、拟杆菌属bacteroides、梭杆菌门fusobacteria、乳杆菌属lactobacillus、链球菌属streptococcus、肠球菌属enterococcus、气球菌属aerococcus、葡萄球菌属staphylococcus、孪生菌属gemella、韦荣氏菌科veillonellaceae、支原体科mycoplasmataceae、梭状芽孢杆菌clostridia、衣原体科chlamydiaceae、肠杆菌科enterobacteriaceae、阴道毛滴虫trichomonas_vaginalis和真菌fungi的一种或多种qpcr引物和探针；其中，放线菌、拟杆菌属、梭杆菌门、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、气球菌属、葡萄球菌属、孪生菌属、韦荣氏菌科、支原体科、梭状芽孢杆菌、衣原体科、肠杆菌科、阴道毛滴虫和真菌上游引物分别为act-f、bac-f、fus-f、lac-f、str-f、ent-f、aer-f、sta-f、gem-f、vei-f、myc-f、clo-f、chl-f、e1-f、tri-f和fun-f，其序列依次如seq id no.1～16所示；放线菌、拟杆菌属、梭杆菌门、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、气球菌属、葡萄球菌属、孪生菌属、韦荣氏菌科、支原体科、梭状芽孢杆菌、衣原体科、肠杆菌科、阴道毛滴虫和真菌下游引物分别为act-r、bac-r、fus-r、lac-r、str-r、ent-r、aer-r、sta-r、gem-r、vei-r、myc-r、clo-r、chl-r、e1-r、tri-r和fun-r，其序列依次如seq id no.17～32所示；检测放线菌、拟杆菌属、梭杆菌门、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、气球菌属、葡萄球菌属、孪生菌属、韦荣氏菌科、支原体科、梭状芽孢杆菌、衣原体科、肠杆菌科、阴道毛滴虫和真菌的探针分别为act-p、bac-p、fus-p、lac-p、str-p、ent-p、aer-p、sta-p、gem-p、vei-p、myc-p、clo-p、chl-p、e1-p、tri-p和fun-p，其序列依次如seq id no.33～48所示；上述探针的5’端标记有不同的荧光发射基团，3’端标记有淬灭基团。

4、进一步地，用于检测多种生殖道微生态菌群的检测组合物，act-p的5’端荧光发射基团为texas red，3’端淬灭基团为bhq1；bac-p的5’端荧光发射基团为hex，3’端淬灭基团为bhq2、fus-p的5’端荧光发射基团为hex，3’端淬灭基团为bhq2；lac-p的5’端荧光发射基团为texas red，3’端淬灭基团为bhq2；str-p的5’端荧光发射基团为fam，3’端淬灭基团为bhq1；ent-p的5’端荧光发射基团为hex，3’端淬灭基团为bhq2；aer-p的5’端荧光发射基团为texas red，3’端淬灭基团为bhq2；sta-p的5’端荧光发射基团为fam，3’端淬灭基团为bhq1；gem-p的5’端荧光发射基团为fam，3’端淬灭基团为bhq1；vei-p的5’端荧光发射基团为texas red，3’端淬灭基团为bhq2；myc-p的5’端荧光发射基团为hex，3’端淬灭基团为bhq1；clo-p的5’端荧光发射基团为fam，3’端淬灭基团为bhq2；chl-p的5’端荧光发射基团为fam，3’端淬灭基团为bhq2；e1-p的5’端荧光发射基团为texas red，3’端淬灭基团为bhq2；tri-p的5’端荧光发射基团为fam，3’端淬灭基团为bhq1；fun-p的5’端荧光发射基团为hex，3’端淬灭基团为bhq2。

5、一种用于检测多种生殖道微生态菌群的多重荧光定量pcr检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的用于检测多种生殖道微生态菌群的检测组合物。

6、进一步地，所述的用于检测多种生殖道微生态菌群的多重荧光定量pcr检测试剂盒还包括含有mg2+的pcr反应缓冲液、dntp、以及pcr扩增酶。

7、所述的用于检测多种生殖道微生态菌群的多重荧光定量pcr检测试剂盒用于同时检测放线菌、拟杆菌属、梭杆菌门、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、气球菌属、葡萄球菌属、孪生菌属、韦荣氏菌科、支原体科、梭状芽孢杆菌、衣原体科、肠杆菌科、阴道毛滴虫和真菌。

8、进一步地，用于检测多种生殖道微生态菌群的多重荧光定量pcr检测试剂盒，pcr引物和探针分成第一组分、第二组分、第三组分、第四组分、第五组分以及第六组分。

9、其中，所述第一组分包括所述链球菌属、肠球菌属和乳杆菌属的引物和探针。

10、所述第二组分包括所述支原体科、衣原体科和韦荣式菌科的引物和探针。

11、所述第三组分包括所述阴道毛滴虫、梭杆菌门和气球菌属的引物和探针。

12、所述第四组分包括所述放线菌、真菌和梭状芽孢杆菌的引物和探针。

13、所述第五组分包括所述葡萄球菌属、拟杆菌门和肠杆菌科的引物和探针。

14、所述第六组分包括所述孪生菌属的引物和探针。

15、一种用于检测多种生殖道微生态菌群的实时荧光定量pcr的检测方法，所述检测方法为提取待测样本中的核酸作为模板，加入含有所述检测组合物的反应体系中进行多重荧光pcr反应，通过不同荧光通道的多重qpcr反应结果判断所测样本中是否含有放线菌、拟杆菌属、梭杆菌门、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、气球菌属、葡萄球菌属、孪生菌属、韦荣氏菌科、支原体科、梭状芽孢杆菌、衣原体科、肠杆菌科、阴道毛滴虫和真菌，阳性检测结果的判断依据为对应荧光通道内出现扩增曲线且ct值≤35。

16、所述的用于检测多种生殖道微生态菌群的实时荧光定量pcr的检测方法，所述检测组合物分成第一组分、第二组分、第三组分、第四组分、第五组分以及第六组分。

17、其中，所述第一组分包括所述链球菌属、肠球菌属和乳杆菌属的引物和探针。

18、所述第二组分包括所述支原体科、衣原体科和韦荣式菌科的引物和探针。

19、所述第三组分包括所述阴道毛滴虫、梭杆菌门和气球菌属的引物和探针。

20、所述第四组分包括所述放线菌、真菌和梭状芽孢杆菌的引物和探针。

21、所述第五组分包括所述葡萄球菌属、拟杆菌门和肠杆菌科的引物和探针。

22、所述第六组分包括所述孪生菌属的引物和探针。

23、所述的检测多种菌的多重荧光定量pcr的方法，所述多重荧光定量pcr反应过程包括37℃，2分钟；95℃，30秒；40个循环，95℃，10秒，60℃，30秒测量各通道的荧光信号。

24、与现有技术比，本发明的有益效果如下。

25、本发明分析了放线菌actinobacteriota、拟杆菌属bacteroides、梭杆菌门fusobacteria、乳杆菌属lactobacillus、链球菌属streptococcus、肠球菌属enterococcus、气球菌属aerococcus、葡萄球菌属staphylococcus、孪生菌属gemella、韦荣氏菌科veillonellaceae、支原体科mycoplasmataceae、梭状芽孢杆菌clostridia、衣原体科chlamydiaceae、肠杆菌科enterobacteriaceae、阴道毛滴虫trichomonas_vaginalis和真菌fungi16种保护菌的基因组信息与特性，最终选择了16s rrna保守区域，并在这些保守区域中设计出针对检测生殖道微生态菌群的特异性引物和探针序列。通过大量的筛选和优化，最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合序列，建立了一种实时荧光定量pcr(real-time pcr)方法，以取代16s rrna基因测序技术来表征阴道微生物。阴道菌群覆盖率达80％以上，确定目标菌群。引物和探针设计基于tos的16s rrna基因保守序列。

26、本发明比较qpcr和16s测序获得的相对丰度。结合qpcr获得的不同靶标拷贝数来确定不同的疾病类型，并与收集的38份临床样本进行比较。根据qpcr结果确定不同的疾病类型，并与收集的38份临床样本进行比较。本发明提供的试剂盒和qpcr检测结果与16s测序结果具有良好的相关性，对微生物的存在具有较高的灵敏度。重要的是，试剂盒设计的通道可以准确地确定不同的阴道样本。本发明提供的试剂盒及检测方法可作为宏基因组测序的替代方法，合理设计表达阴道菌群的靶点和引物可以很好地代表阴道菌群。由于其性价比优势，可以为临床快速检测提供强有力的检测手段。