一种改性多糖微球固定化酵母的制备方法

1.本发明属于酵母制备技术领域，具体涉及一种改性多糖微球固定化酵母的制备方法。


背景技术：

2.为了寻找可持续发展和生物经济型的新技术，生物催化技术成为了研究的热点，从可再生资源生产普通化学品到精细化学品的合成或药品的高选择性合成，生物催化技术在所有这些应用中起到了至关重要的作用。全细胞催化作为生物催化的一个重要分支，近年来受到了广泛的关注，全细胞催化剂，无论是自然产生的生物体还是转基因表达宿主，都是最便宜的催化剂配方。
3.由于游离的细胞在生产催化的过程中需要消耗大量的种子液，且发酵后的细胞难以回收增大了经济开支。因此，固定化细胞技术成为了生物工程技术的重点研究项目之一。固定化细胞技术是指利用物理或化学的方法将细胞限定在一定的空间区域内，但仍旧能保持其生物活性并可以反复使用的方法，通过固定化细胞技术可以使单位时间内的生产量提高。固定化细胞技术的关键是采用固定化的载体材料，载体材料的正确选择可以很好的保持细胞的活性，同时使游离的细胞发酵过后仍能回收利用，减少经济开支。
4.传统的固定化载体材料多采用亲水性材料，其仅能应用于水相体系，在进行固定化非水相生物催化的反应时，亲水性的载体材料会阻碍油溶性代谢底物或产物在微球上的扩散传递，限制了反应过程。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明提供一种改性多糖微球固定化酵母的制备方法，该方法采用乳化-内部凝胶化工艺制备的固定化酵母细胞不需要添加表面活性剂即可形成油包水的液滴，固定化载体材料可以很好的保持细胞的活性及稳定性，并有利于细胞油溶性代谢底物或产物在微球上的扩散，降低其产生的细胞毒性，且通过控制不同的条件能够选择性地控制目标产物的扩散传递速率。
6.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种改性多糖微球固定化酵母的制备方法，包括以下步骤：
7.s1.sa-g-pvac接枝共聚物的合成：配制浓度为1％(w/v)的海藻酸钠(sa)溶液，搅拌至完全溶解。将上述sa溶液置于三颈烧瓶中，通入n2，待水浴温度上升到60℃时，加入0.1-1.0ml的5mmol/l的过硫酸钾溶液，待反应10min，加入5-15μl的单体乙酸乙烯酯vac反应4h。将冷却后的反应液体缓慢引流于无水乙醇溶液中，收集凝胶，得到sa-g-pvac；然后经冷冻干燥机干燥处理，得到白色絮状物sa-g-pvac；
8.s2.称取s1制备得到的sa-g-pvac，溶于生理盐水中，配制成浓度为0.5-2.0mg/ml的sa-g-pvac溶液，将sa-g-pvac溶液与酵母菌细胞(5*10
5-5*108/ml)均匀混合，利用乳化-内部凝胶化方法制备sa-g-pvac固定化酵母细胞微球；
9.s3.将s2制备的微球与壳聚糖溶液以1:2-1:20的体积比反应2-30min，之后用0.9％的氯化钠溶液洗掉多余的壳聚糖，得到sa-g-pvac/cs固定化酵母。
10.进一步的，步骤s1中合成的sa-g-pvac接枝共聚物的取代度为5％-30％。
11.进一步的，步骤s2中将sa-g-pvac溶液与酵母细胞均匀混合，溶液中的菌浓为5*10
5-5*108/ml，加入纳米级碳酸钙混匀作为水相，取液体石蜡作为油相，将上述水相体系缓慢加入该油相体系中，使得水油两相体系的比例为1:1-1:10。反应半小时后加入冰乙酸以解离出钙离子，反应5-30min后，加入等体积的去离子水，然后通过水油分离获得固定化酵母细胞的海藻酸钙凝胶微球。
12.进一步的，步骤s3中将sa-g-pvac固定化酵母微球与选定分子量的1-10g
·
l-1
的壳聚糖溶液以1:3-1:10的体积比反应10min，用0.9％的氯化钠溶液洗掉多余的壳聚糖，得到sa-g-pvac/cs固定化酵母微囊。其中，壳聚糖为平均分子量在1万-20万，脱乙酰度在80-100％。
13.上述获得的微囊化酵母细胞可应用于各种生物反应器的连续发酵培养，且微球形态在整个发酵过程中球形度稳定、细胞泄露率低。生物反应器包括但不限于各种桨叶形式的发酵罐；旋转生物反应器；流化床生物反应器；固定床生物反应器；扩张床生物反应器；中空纤维生物反应器等。
14.上述获得的微囊化酵母细胞可应用于非水相催化，包括油溶性底物和/或油溶性产物的反应，可以有效降低油溶性物质对细胞的毒性。
15.本发明与现有技术相比的有益效果是：
16.1.本发明中制备微球的多糖材料是经过两亲改性的多糖材料，这种固定化细胞的载体材料可以很好的保持细胞的活性及稳定性，有利于细胞油溶性代谢底物或产物在微球上的扩散，降低其产生的细胞毒性。
17.2.由于本发明采用的是两亲改性的海藻酸钠材料，而该材料用传统的锐孔挤出法很难制备出良好球形度的水凝胶微球。因此，本发明的另一大创新点，是将该两亲改性的海藻酸钠材料用乳化-内部凝胶化技术制备水凝胶微球，既解决了微球球形度问题，也利于规模化放大，满足生物反应器用量需求。
18.3.本发明中采用的固定化技术是乳化-内部凝胶化技术，由于载体材料是两亲性的，因此在乳化-内部凝胶化过程中不需要添加表面活性剂即可形成油包水的液滴，且由于乳化技术制备的微球的球形度好，凝胶微球与壳聚糖反应成膜均匀，因此，该技术制备的微球可应用于发酵罐的连续发酵培养中，仍然保持微球的完整性，细胞泄漏低。
附图说明
19.下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明
20.图1是sa-g-pvac接枝共聚物的合成示意图；
21.图2是乳化-内部凝胶化技术制备改性多糖微球固定化酵母的流程图；
22.图3是改性多糖微球固定化酵母的显微图。
具体实施方式
23.下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本
发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
24.实施例1
25.(1)配制浓度为1％的海藻酸钠(sa)溶液，搅拌至完全溶解，将其置于4℃的冰箱中冷藏过夜除气泡。
26.(2)将上述sa溶液置于三颈烧瓶中，按图1连接好装置，打开n2，待水浴温度上升到60℃时，稳定几分钟，加入一定量的5mmol/l的过硫酸钾溶液，待反应十分钟后，用移液枪加入一定量的单体乙酸乙烯酯vac反应4h。
27.(3)反应结束后，将冷却后的三颈烧瓶内的液体缓慢引流于一定体积的无水乙醇溶液中，收集凝胶，得到sa-g-pvac。然后经冷冻干燥机干燥处理，得到白色絮状物sa-g-pvac，接枝率为16.9％。
28.(4)将上述制备的sa-g-pvac白色絮状物溶于生理盐水中，配制成浓度为15mg/ml的sa-g-pvac溶液，放入高压蒸汽灭菌锅，进行灭菌处理，然后，将其放于4℃的冰箱冷藏过夜除气泡。
29.(5)在sa-g-pvac溶液中加入一定量的碳酸钙混悬液，使sa-g-pvac溶液与碳酸钙充分混匀。取一定量活化的bdx细胞种子液，用生理盐水稀释十倍，通过血球计数板计数，计算得到菌浓，离心弃上清。将菌液、碳酸钙与sa-g-pvac溶液混匀作为水相，水相中bdx的密度为5
×
106/ml。
30.(6)将液体石蜡作为油相，以1:3的比例混合水油两相，200r/min搅拌30min，形成稳定的乳液后，滴加冰醋酸以解离出ca
2+
，进行凝胶化反应，反应10min。加入去离子水进行破乳，并收集胶珠，之后用1％的吐温水溶液对胶珠进行清洗，将清洗后的胶珠与1.1％的氯化钙水溶液进一步凝胶化反应20分钟，获得固定化酵母细胞的sa-g-pvac凝胶微球。
31.(7)将清洗好的胶珠与平均分子量5万的0.5％的壳聚糖(cs)溶液以1:10的体积比反应10min，配制0.9％的生理盐水，对微囊进行清洗，洗掉其表面多余的壳聚糖，得到sa-g-pvac/cs固定化酵母。
32.(8)将步骤(7)获得的sa-g-pvac/cs固定化酵母细胞，按照1:5(v/v)比例接入10l的生物反应器中，与转化培养基(含l-苯丙氨酸5g/l)和油酸乙酯的非水相体系混合，30℃、200r
·
min-1
的条件下发酵，控制发酵液ph 6.8～7.0，酵母细胞很快进入对数生长期，菌浓和产物2-苯乙醇浓度快速增长，在24h进入稳定生长期，菌浓达到5
×
109/ml，细胞活性95％以上，2-苯乙醇浓度可达6.5g/l。
33.对比例1
34.(1)配制浓度为15mg/ml的sa溶液，放入高压蒸汽灭菌锅，进行灭菌处理，然后，将其放于4℃的冰箱冷藏过夜除气泡。
35.(2)在sa溶液中加入一定量的碳酸钙混悬液，使sa溶液与碳酸钙充分混匀。取一定量活化的bdx细胞种子液，用生理盐水稀释十倍，通过血球计数板计数，计算得到菌浓，离心弃上清。将菌液、碳酸钙与sa溶液混匀作为水相，水相中bdx的密度为5
×
106/ml。
36.(3)将液体石蜡作为油相，以1:3的比例混合水油两相，1％span80作为表面活性剂，200r/min搅拌30min，形成稳定的乳液后，滴加冰醋酸以解离出ca
2+
，进行凝胶化反应，反应10min。加入去离子水进行破乳，并收集胶珠，之后用1％的吐温水溶液对胶珠进行清洗，将清洗后的胶珠与1.1％的氯化钙水溶液进一步凝胶化反应20分钟，获得固定化酵母细胞
的海藻酸钙胶珠。
37.(4)将清洗好的胶珠与平均分子量5万的0.5％的壳聚糖(cs)溶液以1:10的体积比反应10min，配制0.9％的生理盐水，对微囊进行清洗，洗掉其表面多余的壳聚糖，得到sa/cs固定化酵母。
38.(5)将步骤(4)获得的sa/cs固定化酵母细胞，按照1:5(v/v)比例接入10l的生物反应器中，与转化培养基(含l-苯丙氨酸5g/l)和油酸乙酯的非水相体系混合，30℃、200r
·
min-1
的条件下发酵，控制发酵液ph 6.8～7.0，酵母细胞很快进入对数生长期，菌浓和产物2-苯乙醇浓度快速增长，在24h进入稳定生长期，菌浓达到2
×
109/ml，细胞活性为70％以上，2-苯乙醇浓度为4g/l。
39.以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。