一种基于CRISPR/Cas12a和指数滚环扩增检测miRNA155的方法

本发明涉及一种基于crispr/cas12a和指数滚环扩增检测mirna155的方法，属于医学检测领域。

背景技术：

1、mirna是由大约20-25个核苷酸构成，且具有调控功能的小型非编码rna，通过与靶标mrna的3'utr结合进行转录后抑制，参与调节细胞分化、凋亡、增殖和信号转导等生物学过程，发挥其生物学调控功能。已有研究证明了mirna的异常表达与人类癌症的发生和发展密切相关，其中mirna155的高表达与乳腺癌的发生有直接的关系，mirna已被公认为癌症诊断和预后的有效生物标志物。因此，快速、准确地检测mirnas在疾病诊断和病理分析中至关重要。通常mirnas具有长度短、易降解、序列相似性和低丰度等固有特性，对其进行高稳定性、高灵敏度和高选择性的定量检测仍然是一个挑战。目前最常用的核酸检测方法是基于聚合酶链式反应(pcr)的信号放大技术，即在pcr体系中加入分子信标，通过分子信标与pcr产物的结合来释放荧光。然而，基于pcr的检测技术高度依赖于昂贵且精密的热循环设备，且需要专门的技术人员操作，限制了pcr技术在低资源配制区域的应用，难以实现现场实时检测和即时诊断。

2、近几年发展起来的恒温扩增技术是用于mirna检测最常用于信号放大的方法，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比pcr技术更为简单方便，它摆脱了对热循环设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。包括滚环扩增(rca)、催化发夹装配技术(cha)、杂交链式反应(hcr)、链置换扩增(sda)和指数扩增。其中，sda方法涉及较强的非特异性扩增，熵变化驱动的cha和hcr扩增效率低，rca和指数扩增的高扩增效率使其成为有效的mirna检测扩增策略。crispr/cas生物传感器是近几年出现的新型分子诊断技术，其本身就是一种信号放大系统，结合rca恒温扩增，可构建出级联放大的超灵敏mirna诊断平台，特别适合低丰度mirna的检测。此外，crispr/cas对核酸的识别具有序列依赖性，可精确区分单碱基突变靶标，具有高分辨率，确保复杂样本检测的高特异性。

3、但在现有技术中，在利用滚环扩增rca反应时，需要利用挂锁探针与待检测目标物以及t4连接酶进行扩增程序，导致非特异性扩增和背景信号的产生，降低检测方法的灵敏度和准确性。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明开发了一种新型等温扩增策略t-erca/cas12a系统，用于mirna155检测。图1展示了t-erca/cas12a体系的检测过程，包括t-erca扩增反应和crispr/cas12a识别两个部分。首先，在靶标(mirna-155)存在的情况下，t-erca反应被触发，由于哑铃探针的扩增模板含有两个切刻内切酶nt.bbvci识别位点，在phi29 dna聚合酶的辅助下，可实现指数循环扩增，生成大量的ssdna产物。随后，ssdna产物可以被cas12a/crrna识别，激活cas12a/crrna的反式切割活性，并对外源荧光探针进行持续不断的剪切，产生荧光信号，进一步放大信号。因此，基于t-erca和crispr/cas12a的双重扩增作用，可以实现对mirna-155的高灵敏度检测。

2、本发明提供了一种组合物，所述组合物含有crispr/cas12a蛋白、携带有两个切刻内切酶识别位点的哑铃探针、crrna、荧光信号探针、dna聚合酶、切刻内切酶。

3、在一种实施方式中，所述切刻内切酶识别并切割哑铃探针。

4、在一种实施方式中，所述切刻内切酶选自nt.bbvci和/或nb.btsi中的一种或多种。

5、在一种实施方式中，所述哑铃探针的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、在一种实施方式中，所述哑铃探针的5’端经磷酸基团修饰。

7、在一种实施方式中，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.6所示。

8、在一种实施方式中，所述荧光信号探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，荧光信号探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。

9、在一种实施方式中，所述荧光基团包括hex、fam、rox、fitc、cy3或cy5，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3、trmra、mgbnfq或dabcyl。

10、在一种实施方式中，所述dna聚合酶包括phi29聚合酶。

11、在一种实施方式中，所述的cas12a蛋白选自fncas12a、ascas12a、lbcas12a、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a、bocas12a或lb4cas12a中的一种。

12、本发明提供了一种检测mirna155的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有上述组合物。

13、本发明提供了上述组合物或上述试剂盒在检测mirna155中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

14、在一种实施方式中，所述试剂盒中含有dntp。

15、在一种实施方式中，所述应用包括以下步骤：

16、(1)合成哑铃探针：利用dna连接酶使携带有两个切刻内切酶识别位点的哑铃探针闭环化。

17、(2)t-erca反应：将步骤(1)合成的哑铃探针、dna聚合酶、限制性内切酶以及dntp混合进行扩增反应，获得扩增产物ssdna。

18、(3)crispr/cas12a识别和荧光信号采集：将步骤(2)中获得的ssdna中加入核苷酸序列如seq id no.6所示的crrna、cas12a蛋白、荧光信号探针混合反应。

19、在一种实施方式中，步骤(1)中，所述dna连接酶为t4 dna连接酶。

20、在一种实施方式中，步骤(1)中，将哑铃探针溶液和t4 dna连接酶缓冲液置于95℃下处理3min后，缓慢冷却至室温20min，加入t4 dna连接酶，置于37℃孵育1h；加入，核酸外切酶孵育2h；最后80℃灭活20min。

21、在一种实施方式中，所述核苷酸外切酶包括exoi和exoiii。

22、在一种实施方式中，步骤(2)中，将20μl的0.4μm闭环哑铃探针、0.4u/μlphi29聚合酶、0.3u/μl限制性内切酶以及250mm dntp进行扩增反应。

23、在一种实施方式中，步骤(2)中，所述扩增反应的条件为37℃下反应100min。

24、在一种实施方式中，步骤(3)中，将4μl扩增产物ssdna、2μl 1μm crrna、2μl 1μmcas12a、2μl荧光信号探针充分混合。

25、在一种实施方式中，步骤(3)中，所述混合反应的条件为在37℃反应20min后，加入ddh2o，通过荧光分光光度计(perkinelmer)采集荧光光谱和荧光信号强度，

26、在一种实施方式中，所述荧光分光光度计的激发波长为490nm，发射波长为560nm。

27、有益效果：

28、1)t-erca引入哑铃结构扩增模板，在闭环连接时，不需要外加挂锁探针，用于扩增dna模板可以自配对，将连接端点拉在一起，进行t4连接酶闭环连接。减少扩增程序，也避免了由于引入挂锁探针而带来的非特异性扩增和背景信号的产生。此外，哑铃结构扩增模板闭环过程不需要靶标mirna作为连接探针，与传统rca相比，t-erca避免了长时间的连接过程造成mirna降解所因为的检测不准确和灵敏度低的问题。

29、2)t-erca的哑铃结构扩增模板携带两个切刻内切酶位点，在滚环扩增产物会在切刻内切酶位点处被切断，产物又可以作为滚环扩增引物进行下一步扩增，实现指数信号放大。相比于传统rca及其它恒温扩增，具有更高的扩增效率和检测灵敏度。

30、3)crispr/cas12a本身是一种信号放大系统，与t-erca联用，可建立级联信号放大体系，进一步提高检测灵敏度。t-erca反应的扩增产物ssdna被crispr/cas12a识别，并激活其反式切割活性，切割外源单链信号探针，释放荧光信号。t-erca和crispr/cas12a的双重扩增效应确保了t-erca/cas12a检测体系具有较高灵敏度，检测范围从1fm到5nm，检测限为0.31fm。

31、4)crispr/cas12a反式切割，使其兼具信号读出功能，无需外加信号读出体系，使t-erca/cas12a系统简单化，缩短检测时间。

32、5)crispr/cas系统结合等温扩增技术的实验执行温度良好匹配，t-erca容易集成，能实现单管非开盖检测，避免污染和减少检测程序，避免了热循环仪器的使用，适合作为临床poct检测部署。

33、6)与传统的聚合酶链反应相比，t-erca具有反应条件温和、扩增效率高的特点。

34、7)t-erca扩增和crispr/cas12a识别具有序列依赖性，t-erca/cas12a检测体系增强了mirna155检测的特异性，可将mirna155与其家族同源mirna准确区分开来。

35、8)鉴于crispr/cas12a的可编程性，t-erca/cas12a可被改造成为检测其他mirna的通用平台，为crispr/cas传感器平台在临床诊断检测提供新思路和理论基础。