宫颈癌相关基因甲基化的检测引物、探针、试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种宫颈癌相关基因甲基化的检测引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

1、宫颈癌是发生在宫颈的恶性肿瘤，可分为两种组织学类型：腺型(ac)和鳞状细胞癌(scc)，scc较为常见，发生率为70％。ac起源于排列在宫颈管内的腺细胞，而scc起源于排列在宫颈外部的鳞状细胞，该鳞状细胞向宫颈外开口生长。鳞状细胞和薄而扁平的腺细胞所在的区域称为转化区，大多数肿瘤起源于该区。发生宫颈癌的最常见原因是持续性感染人乳头瘤病毒(hpv)，hpv占女性宫颈癌病例的90-100％，尤其是35岁以上的女性。

2、目前常用的宫颈癌筛查方式有宫颈细胞检测和hpv核酸检测。宫颈细胞检测属于细胞学的筛查，需要严格的操作环境，没有普遍性，并且细胞学筛查的敏感性极低，结果可靠性差；hpv核酸检测虽然具有较高的敏感性和较强的特异性，但实验室处理需求与成本均较高，结果获取周期较长。因此目前亟需一种方便快捷、灵敏度高、特异性强的宫颈癌筛查方式。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是为了提供一种可以克服目前甲基化基因检测技术灵敏度不够高、特异性差等缺点的且适用大规模人群的方便快捷的宫颈癌相关基因甲基化的检测引物、探针、试剂盒及方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

3、本发明提供了一种宫颈癌相关基因甲基化的检测引物，上述检测引物包括：

4、针对adcyap1基因：

5、上游引物adcyap1-f：agatattaacgttagacggcg(如seq id no.1所示)；

6、下游引物adcyap1-r：gactccgaaccatcgaaa(如seq id no.2所示)；

7、针对ajap1基因：

8、上游引物ajap1-f：tttcgcgtgttattcggt(如seq id no.3所示)；

9、下游引物ajap1-r：gacaacgcaaacgaaacct(如seq id no.4所示)；

10、针对cdkn2a基因：

11、上游引物cdkn2a-f：cggagtttaattgcgtcgat(如seq id no.5所示)；

12、下游引物cdkn2a-r：aacaccaccaacgtatcca(如seq id no.6所示)；

13、针对gata4基因：

14、上游引物gata4-f：tggagagtgggttttgaaagtt(如seq id no.7所示)；

15、下游引物gata4-r：aacacccgcgaccacaaa(如seq id no.8所示)；

16、针对mir124基因：

17、上游引物mir124-f：ttggtgaattagagtatgcgtgt(如seq id no.9所示)；

18、下游引物mir124-r：tccaaacgactccgcaac(如seq id no.10所示)；

19、针对lhx8基因：

20、上游引物lhx8-f：ttttcgttgttttagtcgag(如seq id no.11所示)；

21、下游引物lhx8-r：ccaaaactaatcgtccta(如seq id no.12所示)；

22、针对pax1基因：

23、上游引物pax1-f：ataggagttttgtatcgc(如seq id no.13所示)；

24、下游引物pax1-r：tttaattttatttccgccac(如seq id no.14所示)；

25、针对sox1基因：

26、上游引物sox1-f：ggcgcgtcgttttgttagaagt(如seq id no.15所示)；

27、下游引物sox1-r：cgtaaccaaattacaactccgctt(如seq id no.16所示)。

28、本发明还提供了一种宫颈癌相关基因甲基化的探针，上述探针包括：

29、针对adcyap1基因：

30、adcyap1-p：5′vic-ctcttcctctaacctaatcccgaa-3′bhq(如seq id no.17所示)；

31、针对ajap1-p基因：

32、ajap1-p：5′fam-aacgccgccgaataatattacca-3′bhq(如seq id no.18所示)；

33、针对cdkn2a-p基因：

34、cdkn2a-p：5′vic-accctcccgaacaacgtcgta-3′bhq(如seq id no.19所示)；

35、针对gata4-p基因：

36、gata4-p：5′fam-tcctcgccgcaaccgaaatccta-3′bhq(如seq id no.20所示)；

37、针对mir124-p基因：

38、mir124-p：5′cy5-ttacctcctacgccgctctcc-3′bhq(如seq id no.21所示)；

39、针对lhx8-p基因：

40、lhx8-p：5′fam-ataaaaggttagaaggtcgtt-3′bhq(如seq id no.22所示)；

41、针对pax1-p基因：

42、pax1-p：5′vic-cactcccgaaacaacgac-3′bhq(如seq id no.23所示)；

43、针对sox1-p基因：

44、sox1-p：5′cy5-acgctcgatcctcaacgacctcc-3′bhq(如seq id no.24所示)。

45、需要说明的是，对上述8个基因进行甲基化检测时，各基因所用的检测引物和探针包括但不限于上述的检测引物和探针序列，本领域技术人员根据本发明所公开的基因，可以设计或选择上述所示范围之外的其他检测引物和探针，因此，无论以何种引物探针实现上述基因甲基化的检测，其均属于本发明的保护范围。

46、本发明还提供了一种宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂盒，上述检测试剂盒包括如上所述的检测引物和如上所述的探针。

47、在一些实施方式中，上述检测试剂盒还包括人非甲基化全基因组dna、亚硫酸氢盐转化后的siha细胞dna和人基因组dna的混合液、无核酸酶水中的至少一种。

48、本发明还提供了一种宫颈癌相关基因甲基化的检测方法，上述方法不用于诊断用途，上述方法采用如上所述的检测引物和如上所述的探针，或采用如上所述的检测试剂盒对人宫颈癌相关基因甲基化程度进行实时荧光pcr定量检测。

49、在一些实施方式中，上述宫颈癌相关基因甲基化的检测方法具体包括如下步骤：

50、提取宫颈脱落细胞dna；

51、对提取的dna进行亚硫酸氢盐转化处理；

52、将亚硫酸氢盐处理后的dna作为模板，采用权利要求1上述的检测引物和权利要求2上述的探针进行定量多重甲基化特异性pcr检测；

53、采集荧光信号，基于上述荧光信号读取ct值，进行结果判定。

54、在一些实施方式中，上述检测方法还包括，采用actb作为内参基因。针对上述内参基因actb的检测引物：

55、上游引物actb-f：ggttaggaaggaggttgtttgtttt(如seq id no.25所示)；

56、下游引物actb-r：atcatctttcccaccaaactataacc(如seq id no.26所示)；

57、针对上述内参基因actb的探针：

58、ajap1-p：5′fam-aacgccgccgaataatattacca-3′bhq(如seq id no.27所示)。

59、在一种实施方式中，上述定量多重甲基化特异性pcr的反应体系为probe qpcrmix 10μl，10μm的上游引物0.6μl，10μm的下游引物0.6μl，10μm的探针0.4μl，模板2μl，最后采用双蒸水将溶液的体积补齐至20μl。

60、在一种实施方式中，上述定量多重甲基化特异性pcr的反应条件为95℃预变性15s；95℃变性5s，60℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。

61、本发明还提供了一种检测adcyap1、ajap1、cdkn2a、gata4、lhx8、pax1、sox1和mir214基因甲基化程度的试剂在制备宫颈癌相关基因甲基化的检测试剂盒中的应用。

62、本发明提供的上述技术方案的有益效果至少包括：

63、本发明的一种宫颈癌相关基因甲基化的检测引物、探针、试剂盒及方法，通过发现adcyap1、ajap1、cdkn2a、gata4、lhx8、pax1、sox1和mir214这8个基因的甲基化程度与宫颈癌发展水平的相关性，从而设计了独特的宫颈癌甲基化相关的8基因的检测引物和探针，检测宫颈癌样本的全基因dna中以上8个基因的甲基化程度，采用多基因的生物标志物甲基化的评估显著提高了宫颈癌检测的敏感性和特异性。本发明采用了多重q-msp的方法，适合大规模人群筛查和常规分子诊断的快速检测宫颈癌甲基化的生物标志物，从而对宫颈癌的早期诊断、预后、治疗反应预测和复发风险评估。