一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用

本发明涉及一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的构建方法及其应用，属于生物技术和代谢工程领域。

背景技术：

1、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ala)是一种非蛋白质类的5碳氨基酸，作为四吡咯化合物的重要前体，参与叶绿素、血红素及维生素b12的合成，广泛存在于微生物，动物及植物细胞中。ala在农业、医药领域具有广泛用途。在农业上，ala作为植物生长调节剂，绿色除草剂和杀虫剂，在医药上，ala作为光动力学药物可以治疗癌症。

2、目前ala的合成主要包括化学合成法和生物合成法。化学合成法由于反应步骤多，副产物多以及得率低限制了其推广应用。绿色经济的生物合成法已成为未来研究发展的趋势，随着生物技术的进步，利用微生物生产ala受到广泛关注。自然界中许多生物可以合成ala，但是这些天然宿主的生产效率低，因此构建工程菌株被看作是提高ala产量的有效手段。ala c5合成途径主要涉及3种酶包括谷氨酰-trnaglu连接酶(由gltx基因表达)、谷氨酰-trnaglu还原酶(由hema基因表达)及谷氨酰-1-半醛氨基转移酶(由heml基因表达)。在目前的报道中，利用ala c5合成途径构建工程菌株主要关注于强化hema和heml基因的表达，对于过表达gltx基因和trnaglu增加ala的前体谷氨酰-trnaglu的合成从而提高ala产量的研究未见报道。而且，目前报道中几乎所有的ala工程菌株都是以葡萄糖为原料通过传统发酵进行生产，存在底物转化率低、发酵液杂质多等缺点，限制了生物法生产ala的应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的一个技术问题是如何进行ala的高效发酵。

2、为解决本发明的技术问题，本发明提供一种产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有谷氨酰-trna连接酶的编码基因、trnaglu的编码基因、谷氨酰-trnaglu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因。

3、上述重组大肠杆菌中，所述谷氨酰-trna连接酶的编码基因、trnaglu的编码基因、谷氨酰-trnaglu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因可以任意顺序排列。在本发明的实施例中，从3’到5’端，依次是谷氨酰-trna连接酶的编码基因、trnaglu的编码基因、谷氨酰-trnaglu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因。

4、上述重组大肠杆菌中，所述谷氨酰-trna连接酶为a1或a2的蛋白质：

5、a1氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；

6、a2将seq id no.2所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-trna连接酶活性的由a1衍生的蛋白质；

7、所述trnaglu为脱氧核糖核酸序列是seq id no.3的转运rna；

8、所述谷氨酰-trnaglu还原酶为b1或b2的蛋白质：

9、b1氨基酸序列是seq id no.4的蛋白质；

10、b2将seq id no.4所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-trnaglu还原酶活性的由b1衍生的蛋白质；

11、所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶为c1或c2的蛋白质：

12、c1氨基酸序列是seq id no.5的蛋白质；

13、c2将seq id no.5所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加得到的具有谷氨酰-1-半醛氨基转移酶活性的由c1衍生的蛋白质。

14、上述重组大肠杆菌中，所述谷氨酰-trna连接酶的编码基因为d1-d3中的任一种dna分子：

15、d1编码链的编码序列是seq id no.1第1-1410位的cdna分子或基因组dna；

16、d2在严格条件下与d1限定的dna分子杂交且编码所述谷氨酰-trna连接酶的cdna分子或基因组dna；

17、d3与d1或d2限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-trna连接酶的cdna分子或基因组dna；

18、所述trnaglu的编码基因为e1-e3中的任一种dna分子：

19、e1编码链的编码序列是seq id no.1第1411-1486位的cdna分子或基因组dna；

20、e2在严格条件下与e1限定的dna分子杂交且编码所述trnaglu的cdna分子或基因组dna；

21、e3与e1或e2限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码所述trnaglu的cdna分子或基因组dna；

22、所述谷氨酰-trnaglu还原酶的编码基因为f1-f3中的任一种dna分子：

23、f1编码链的编码序列是seq id no.1第1487-2737位的cdna分子或基因组dna；

24、f2在严格条件下与f1限定的dna分子杂交且编码所述谷氨酰-trnaglu还原酶的cdna分子或基因组dna；

25、f3与f1或f2限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-trnaglu还原酶的cdna分子或基因组dna；

26、所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因为g1-g3中的任一种dna分子：

27、g1编码链的编码序列是seq id no.1第2738-4030位的cdna分子或基因组dna；

28、g2在严格条件下与g1限定的dna分子杂交且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cdna分子或基因组dna；

29、g3与g1或g2限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cdna分子或基因组dna。

30、上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m napo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1％ sds和1×ssc,0.1％ sds各洗膜一次。

31、上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

32、上述重组大肠杆菌中，所述重组大肠杆菌按照下述的方法构建。

33、为解决本发明的技术问题，本发明还提供构建重组大肠杆菌的方法，包括a1或a2：

34、a1提高作为出发菌的大肠杆菌中谷氨酰-trna连接酶、trnaglu、谷氨酰-trnaglu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因的表达量，得到重组大肠杆菌；

35、a2在作为出发菌的所述大肠杆菌中导入谷氨酰-trna连接酶、trnaglu、谷氨酰-trnaglu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因，得到重组大肠杆菌。

36、上述导入可通过同源重组实现。

37、上述构建方法中，所述重组大肠杆菌通过重组表达载体将含有上文所述的谷氨酰-trna连接酶的编码基因、trnaglu的编码基因、谷氨酰-trnaglu还原酶的编码基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因的重组表达载体导入所述出发菌中实现。

38、上述重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述重组大肠杆菌菌体中的的谷氨酰-trna连接酶、trnaglu、谷氨酰-trnaglu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的表达量高于作为出发菌的大肠杆菌；或所述重组大肠杆菌菌体中的谷氨酰-trna连接酶、trnaglu、谷氨酰-trnaglu还原酶和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的含量高于作为出发菌的大肠杆菌。

39、上述重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述出发菌为大肠杆菌bl21(de3)。

40、上述重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述重组大肠杆菌可为bl21(de3)-pet30a(+)-gltx-trnaglu-hema-heml。

41、本发明还保护上述重组载体，所述重组表达载体可pet30a(+)-gltx-trnaglu-hema-heml。

42、本发明还提供上述重组大肠杆菌在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用，以及上述构建方法在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。

43、本发明还提供一种制备5-氨基乙酰丙酸的方法，包括将上述重组大肠杆菌作为细胞催化剂，催化底物谷氨酸盐生成5-氨基乙酰丙酸。

44、上述制备方法中，所述产5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌工程菌株可优选进行固定化。所述固定化优选为以海藻酸钠作为载体进行包埋。

45、本发明构建了一种用于生产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌的方法：通过过表达谷氨酰-trna连接酶gltx基因和trnaglu提高5-氨基乙酰丙酸的前体谷氨酰-trna的合成，过表达谷氨酰-trnaglu还原酶hema基因和谷氨酰-1-半醛氨基转移酶heml基因，强化谷氨酰-trna下游基因的表达，增强5-氨基乙酰丙酸的合成能力。本发明还公开了利用全细胞催化生产ala的方法，以谷氨酸盐为底物，诱导基因表达后的重组大肠杆菌菌体为细胞催化剂，从50mm谷氨酸盐中可产生4.56g/l ala，底物转化率为75.60％。本发明还公开了固定化细胞催化生产ala的方法，以海藻酸钠作为固定化载体以本发明中的重组大肠杆菌为对象来制备固定化细胞，不仅提高了生物法合成ala的底物转化率，而且其固定化细胞可以多次重复使用。