一种石斛内生真菌螺旋毛壳菌及其在石斛生长中的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种石斛内生真菌螺旋毛壳菌及其在石斛生长中的应用。


背景技术：

2.铁皮石斛是兰科石斛属多年生附生草本植物，主要分布于浙江、安徽、福建等长江流域以南各省，具有滋阴润肺厚肠胃等功效，是我国药典收录的珍稀中药材。铁皮石斛属兰科植物，与大部分兰科植物一样，需与真菌共生才能完成整个生活史。由于野生铁皮石斛资源日趋濒危，目前，铁皮石斛的市场需求主要靠人工栽培，种苗繁育主要以组培快繁为主，但组培苗自身存在移栽成活率低、生长慢、有效要用成分含量低等诸多问题。自然界中，石斛菌根真菌不仅可以促进种子发育和生长，还能增加其抗逆性。
3.近年来，有不少学者在石斛属植物菌根真菌对石斛生长机制机理及相关作用方面开展了大量研究，如何获得效果显著的菌根真菌，进一步促进石斛生长以及增加种苗抗逆性，成为铁皮石斛产业发展需要持续研究的方向。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明的目的之一是提供一种石斛内生真菌螺旋毛壳菌chaetomium spirochaete，菌株号jsnlshqh-5。本发明的另一个目的是提供上述菌株在促进铁皮石斛幼苗生长中的应用。
5.技术方案：本发明的石斛内生真菌螺旋毛壳菌，其分类命名为螺旋毛壳菌chaetomium spirochaete，其分类地位为子囊菌门粪壳菌纲粪壳菌目毛壳菌科毛壳菌属，菌株号为jsnlshqh-5，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.18542，保藏日期为2019年09年02日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
6.该菌株的主要生物学特性为：在pda培养基上培养7d，菌落直径6.8cm，生长速度适中。菌落扁平，菌丝致密，灰褐色，边缘整齐，有色素沉淀，在人工培养条件下易产孢。
7.扩增its区全序列并进行测序，pcr扩增得到的16srna全序列(seq id no.1)ttgtgacgttacctaaaccgttgcttcggcgggcggcgccggggtttaccccccgggcgcccctgggccccaccgcgggcgcccgccggaggtcaccaaactcttgataatttatggcctctctgagtcttctgtactgaataagtcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccatcaagccccgggcttgtgttggggacctgcggctgccgcaggccctgaaaagcagtggcgggctcgctgtcacaccgagcgtagtagcatacatctcgctctgggcgtgctgcgggttccggccgttaaaccaccttttaacccaaggttgacctcggatcaggtaggaagacccgctgaacttaagcatat。
8.本发明石斛内生真菌螺旋毛壳菌在石斛生长中的应用。
9.本发明石斛内生真菌螺旋毛壳菌在促进铁皮石斛幼苗生长中的应用。
10.本发明微生物菌剂制备时，将螺旋毛壳菌菌株jsnlshqh-5制备成液体菌剂，加入铁皮石斛栽培基质中，基质相对含水量维持在60％～80％5～6天，以确保真菌在基质内成活。
11.每立方铁皮石斛栽培基质接种液体菌剂的接种量为30g～50g。
12.所述的液体菌剂制备时，以玉米为培养基质、硫酸铵为外源氮源、葡萄糖为外源碳源，制备成液体培养基；灭菌后接种螺旋毛壳菌进行液体振荡培养，培养结束后将含菌丝球的发酵液打碎成匀浆状菌剂。
13.所述的玉米以玉米浸出液形式加入，取20g～40g玉米粉，加500ml蒸馏水，煮沸30min后过滤，获得玉米浸出液。
14.所述的玉米浸出液添加到到含有硫酸铵、葡萄糖的液体培养基中，121℃，0.11mp下高温灭菌30min，即得液体培养基。
15.所述的液体振荡培养条件为25℃～30℃、12h光照/12黑暗、ph6.4～6.6、120r/min～150r/min液体振荡培养20d～25d。
16.所述的液体培养基中硫酸铵、葡萄糖的质量浓度分别为5.0g/l～7.0g/l、8.0g/l～25.0g/l。
17.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：经检测，本发明螺旋毛壳菌chaetomium spirochaete菌株jsnlshqh-5对铁皮石斛幼苗促生长作用明显，施用后能显著提高铁皮石斛苗的净生长量及叶绿素含量，显著降低其pod酶活，从而促进其生长，增强其抗逆性。同时，该菌株能够人工培养、培养条件简单、施用方便、容易保存，易于规模化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
18.图1为本发明的菌株培养的菌落正面形态图；
19.图2为本发明的菌株培养的菌落背面形态图。
具体实施方式
20.下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
21.实施例1：
22.2017年6月在江苏省句容市江苏农博园内从石斛栽培区生长状态良好的串珠石斛根系分离筛选到一株能促进铁皮石斛幼苗生长的菌株获得的菌株jsnlshqh-5。
23.该菌株在pda平板上培养，菌落扁平，菌丝致密，灰褐色，边缘整齐，有色素沉淀，在人工培养条件下易产孢。
24.扩增its区全序列并进行测序，pcr扩增得到的16srna全序列(seq id no.1)ttgtgacgttacctaaaccgttgcttcggcgggcggcgccggggtttaccccccgggcgcccctgggccccaccgcgggcgcccgccggaggtcaccaaactcttgataatttatggcctctctgagtcttctgtactgaataagtcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccatcaagccccgggcttgtgttggggacctgcggctgccgcaggccctgaaaagcagtggcgggctcgctgtcacaccgagcgtagtagcatacatctcgctctgggcgtgctgcgggttccggccgttaaaccaccttttaacccaagg
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25.经形态学及分子生物学鉴定表明，该菌株为螺旋毛壳菌(chaetomium spirochaete)，其分离地位为子囊菌门粪壳菌纲粪壳菌目毛壳菌科毛壳菌属，菌株号为jsnlshqh-5，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18542，保藏日期为2019年09年02日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
26.实施例2：
27.螺旋毛壳菌chaetomium spirochaete菌株jsnlshqh-5对铁皮石斛促生作用分析。
28.1)以玉米粉为培养基质、硫酸铵为外源氮源、葡萄糖为外源碳源，制备成液体培养基，接种螺旋毛壳菌(chaetomium spirochaete)进行液体振荡培养，培养结束后将含菌丝球的发酵液打碎成匀浆状菌剂。先取30g玉米粉，加500ml蒸馏水，煮沸30min后过滤，获得玉米浸出液，将玉米浸出液加入蒸馏水中，并加入6.0g硫酸铵、15.0g葡萄糖，定容至1l，于121℃和101.3千帕的高压条件下灭菌30min，待培养基质冷却后在无菌条件下接种菌根真菌螺旋毛壳菌(chaetomium spirochaete)菌株jsnlshqh-5，在28℃、120h/min、12h光照+12h黑暗条件下振荡培养20d，培养结束后将含菌丝球的发酵液打碎成匀浆状菌剂，将菌剂混入铁皮石斛栽培基质中，基质相对含水量维持在60％～80％5天，以确保真菌在基质内成活。每立方铁皮石斛栽培基质接种液体菌剂的接种量为30～50g。
29.2)选取铁皮石斛组培苗为栽培材料，将铁皮石斛苗洗净，晾干至根发白，称重后，按照5株/丛，30丛/
㎡
的种植密度种植于上述接菌栽培基质中，并将未接菌基质设置未对照(ck)。
30.3)进行正常的水肥管理，栽培60d后，采用多点随机取样，取出铁皮石斛苗，进行促生效果分析。
31.促生效果分析：
32.1、重增量测定：清洗干净根部和块茎上的栽培基质，自然条件下风干，用分析天平(0.0001g)称取铁皮石斛苗的鲜重，减去移栽前铁皮石斛苗的重量，即得净重增量。
33.2、叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b的含量：称取0.5g左右的健康铁皮石斛叶片，切碎后加入25ml无水乙醇与丙酮的混合浸提液(体积比为1:1)，避光浸提24h。24h后，将浸提液离心，使用紫外可见分光光度计测量各上清液在645nm和663nm波长下的吸光度a645和a663。
34.将测得的数据按以下公式分别计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量：
35.ca(mg/g)＝(12.71a663－2.59a645)*v/1000m；
36.cb(mg/g)＝(22.88a645－4.67a663)*v/1000m；
37.ca+b(mg/g)＝(8.04a663+20.29a645)*v/1000m；
38.上述公式中：v代表体积比为1:1的无水乙醇与丙酮的混合浸提液的最终体积(ml)，m代表所用铁皮石斛叶片的鲜重(g)。
39.3、丙二醛含量测定：称取1g左右的健康铁皮石斛叶片，剪碎后加入2ml 10％tca和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mltca研磨，匀浆在4000r/min离心10min，上清液为样品提取液，然后吸取上所述所得提取液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0.6％tba溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450波长下的消光度。
40.将测得的数据按一下公式计算其含量。
41.c1＝11.71d450；
42.c2＝{6.45(d532-d600)-0.56d450}nw-1
；
43.d450、d532、d600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。n代表提取液总体积(ml)，w代表植物组织鲜重。
44.螺旋毛壳菌chaetomium spirochaete菌株jsnlshqh-5对铁皮石斛组培苗促生效果作用分析：
45.表1-jsnlshqh-5对铁皮石斛组培苗生长影响表
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经检测，本发明螺旋毛壳菌chaetomium spirochaete菌株jsnlshqh-5对铁皮石斛幼苗促生长作用明显，施用后能显著提高铁皮石斛苗的净生长量及叶绿素含量，显著降低其pod酶活，从而促进其生长，增强其抗逆性。同时，该菌株能够人工培养、培养条件简单、施用方便、容易保存，易于规模化生产，具有良好的开发应用前景。