一种连续式酶催化制备纤维素纳米晶的方法

1.本发明属于纳米纤维素的制备技术领域，具体涉及一种连续式酶催化制备纤维素纳米晶的方法。


背景技术：

2.纤维素纳米晶（ cellulose nanocrystal），从天然纤维中提取的一种结晶度很高的纳米级棒状纤维素，由多种来源的纤维素的酸水解得到的直径：5~70 nm，长度：100~250 nm（来自植物纤维素）；100 nm至几微米（来自被膜，藻类，细菌的纤维素）。纤维素纳米晶具有高纵横比、高比表面积、高机械强度和生物相容性、低毒的优势，这些特性使许多潜在的应用成为可能，例如在水和废水处理、3d生物打印、包装、生物传感和药物递送等领域。
3.工业上一般采用64 wt%浓硫酸水解纤维素原料制备纤维素纳米晶。但是浓酸的强毒性和腐蚀性容易造成环境污染和设备腐蚀。研究中，一些较温和的无机酸体系，如盐酸（hcl）、磷酸（h3po4）、h2so4和hcl的混合物，和有机酸体系，如抗坏血酸、草酸，以及lewis酸； fecl3也被用来制备纤维素纳米晶（carbohydrate polymers ,2022,277:118863）。因此，有研究者将hcl与h2so4结合，降低了酸浓度的同时得到了66%~76%的产率（carbohydrate polymers, 2007, 69(3): 607
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611）。酶解也是制备纤维素纳米晶的重要方法，可以在温和的水解条件下进行。但是，生物质原料中的木质素、半纤维素、果胶等杂质均会阻碍酶到达反应位点，从而降低水解效率；有研究者利用酸碱化学处理方法包括氢氧化钠脱木质素，次氯酸盐漂白等从植物废料中制取纤维素材料，为进一步制备纤维素纳米晶打下基础（bioresource technology, 2021, 332:125042; biotechnology advances, 2022, 54:107830；acs sustainable chem. eng, 2020, 8:2287
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2299）。除此之外，meyabadi tf等研究表明由于纤维素是不溶性的，纤维素酶很难扩散到纤维素结构中，由表面及核心需要很长的过程，他们发现48 ℃下，酶在0.05 m ph=4.8的乙酸缓冲液中需要进行175 h才能将废棉水解 (powder technology, 2014, 261:232-240.)。综上所述，纤维素纳米晶在结构上有很多优势，并且它的原料来源广泛，具有潜在的开发价值，但是目前的提取工艺并不理想。因此对于制备纤维素纳米晶的方法研究显得尤为重要。
4.机械化学是在机械力作用下发生的化学反应，可以通过简单的程序高效地改变颗粒结构和提高固体活性的显著特征，在纤维素降解领域已有广泛的研究。seta ft等人在球磨机预处理原料后，采用马来酸水解得到了高产率的纤维素纳米晶（carbohydr polym, 2020; 234: 115942）；lu q等人研究机械力活化辅助磷钨酸水解法提取纤维素纳米晶，产率高达88%（acs sustain chem eng, 2016; 4 (4): 2165~2172）；park nm等也提出了一种仅通过高压均质控制温度提取纤维素纳米晶的简单方法（carbohydr polym, 2019, 223）。虽然技术的组合在一定程度上提高了生产效率，但其处理方式仍存在腐蚀风险、产生有毒有害废水、对设备要求高等缺点，多步处理也使得生产流程复杂化，提高了工艺难度。
5.作为传统无溶剂机械化学技术的扩展，液体辅助研磨技术将少量液体用作添加剂以增强或控制反应性。hammerer等人证明，在铣削过程中惰性固体添加剂的存在可以提高
酶的反应性（chemsuschem, 2020: 13 (1):106
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110）。hammerer 等提出一种在不需要大量溶剂存在的条件下，机械化学促使纤维素高效率、选择性水解为葡萄糖的方法，在最佳工艺条件下，葡萄糖产量是一般方法的3倍(angewandte chemie, 2018, 57 (10): 2621
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2624)；这为机械力促进酶催化制备纤维素纳米晶提供了重要依据。双螺杆挤出机是一种连续化生产的设备，近年来在机械化学有机合成、超分子材料的制备等领域的应用逐渐兴起，可实现高产量、高质量、高效率生产。
6.综上所述，开发更环保和可持续的技术是未来的趋势。采用挤出机促进酶催化制备纤维素纳米晶，可以显著减少有毒有害废水的产生，实现纤维素衍生物的清洁生产，是对传统纤维素纳米晶提取方法的重大突破，对实现纤维素纳米晶的产业化进程具有重要意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种连续式酶催化制备纤维素纳米晶的方法。
8.为达到上述目的，提出以下技术方案：一种连续式酶催化制备纤维素纳米晶的方法，包括如下步骤：将纤维素原料、纤维素酶和醋酸-醋酸钠缓冲溶液混合后，投入双螺旋挤出机，经挤出机的融熔、剪切、输送，得到条状挤出物；待挤出物冷却后，用纯净水反复离心洗涤，至上清液呈中性；洗涤所得沉淀再用水分散离心，得到纤维素纳米晶悬浮液，冷冻干燥得到纤维素纳米晶。
9.进一步地，纤维素原料由棉浆、草浆、竹浆、漂白木浆、中草药药渣、农作物秸秆、玉米芯、甘蔗渣、树皮中的至少一种纤维材料经过纯化制备而成，纯化制备的过程为将纤维材料、氢氧化钠和纯水混合搅拌，加热进行碱处理，碱处理后水洗至中性后，经冷冻干燥得到碱提纤维素，将碱提纤维素加入hcl进行酸处理，酸处理后水洗干燥得到纯化纤维素。
10.进一步地，纤维材料的纯化过程中碱处理所采用的纤维素材料、氢氧化钠和纯水的质量比为1：1-4：20，反应温度为90-121℃，优选110~121℃，反应时间为1-6h，优选2~4 h。
11.进一步地，纤维素材料的纯化过程中酸处理采用的是质量浓度4%~8%的 hcl，优选5%~7% hcl；反应温度60~90 ℃，优选70~80 ℃；反应时间1~4 h，优选2~3 h。
12.进一步地，纤维素酶为长柄木纤维素酶、黑曲霉纤维素酶、康氏木霉纤维素酶、热纤梭菌纤维素酶、绿色木霉纤维素酶或里氏木霉纤维素酶。
13.进一步地，醋酸-醋酸钠缓冲溶液的 ph为4.8。
14.进一步地，醋酸-醋酸钠缓冲溶液的体积与纤维素原料的质量之比为0:1~1.5:1，体积与质量比值的单位是 ml/g。
15.进一步地，双螺杆挤出机的转速为10~70 rpm，双螺杆挤出机的循环时间为1~6 h。
16.进一步地，双螺杆挤出机的一区温度为25~40 ℃；二区温度为25~40 ℃；三区温度为25~40 ℃。
17.本发明采用机械力促进酶催化制备纳米纤维素，其有益效果体现在：1）酶解效率高，反复的循环提高了纤维素的可及性，为纤维素酶提供了重组的反应位点；2）本发明的方法中，机械力促进酶催化一步进行，工艺简单；
3）相比于传统溶液酶解法，挤出酶解过程溶剂用量显著减小，减少了废液和后处理成本；4）本发明工艺操作简单，常温反应，能耗小，对设备要求低，易于大规模、连续化生产。
附图说明
18.图1为实施例9制备得到的纤维素纳米晶的tem图。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
20.所述产品中纳米纤维素的得率（%）= 所得纤维素纳米晶的质量/投入纤维素原料的质量
×
100% 。
21.实施例1将15.00 g稻草秸秆纤维、22.50g naoh、300 ml纯水加入500 ml圆底烧瓶，在121℃油浴中搅拌并加热反应4h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到碱提纤维素；将2.00g碱提纤维素、30 ml 质量浓度为6%的 hcl加入圆底烧瓶，在70℃水浴中反应2h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到纯化纤维素。
22.实施例2将15.00g玉米芯纤维、22.50g naoh、300 ml纯水加入500 ml圆底烧瓶，在110℃油浴中搅拌并加热反应4h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到碱提纤维素；将2.00g碱提纤维素、30 ml质量浓度为6% 的hcl加入圆底烧瓶，在60℃水浴中反应3h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到纯化纤维素。
23.实施例3将15.00 g竹浆、30.00 g naoh、300 ml纯水加入500 ml圆底烧瓶，在121℃油浴中搅拌并加热反应4h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到碱提纤维素；将2.00 g碱提纤维素、30 ml 质量浓度为6% 的hcl加入圆底烧瓶，在70℃水浴中反应3h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到纯化纤维素。
24.实施例4将15.00 甘蔗渣纤维、30.00 g naoh、300 ml纯水加入500 ml圆底烧瓶，在121℃油浴中搅拌并加热反应4h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到碱提纤维素；将2.00 g碱提纤维素、30 ml 质量浓度为5% 的hcl加入圆底烧瓶，在70℃水浴中反应3h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到纯化纤维素。
25.实施例5将2.00 g漂白木浆、30 ml 质量浓度为6% 的hcl加入圆底烧瓶，在70℃水浴中反应2 h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到纯化纤维素。
26.实施例6将2.00 g棉浆、30 ml 质量浓度为6% 的hcl加入圆底烧瓶，在70℃水浴中反应2 h，待反应结束，用水洗到中性后，经冷冻干燥得到纯化纤维素。
27.实施例7
将10.00 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，0.1514 g黑曲霉纤维素酶，5.00 ml ，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，3h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为40.73%。
28.实施例8将10.00 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，0.1514 g长柄木纤维素酶制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，3h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为8.52%。
29.实施例9将10.00 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，0.1514 g长柄木纤维素酶，5.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，3h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为50.71%，纤维素纳米晶的tem图如图1所示，外观呈纺锤形棒状结构，长183.67
±
30.44 nm，宽11.25 nm。
30.实施例10将10.00 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，0.1514 g长柄木纤维素酶，15.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，3h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为25.82%。
31.实施例8-10可以表明，液体添加量加多或者加少都会影响最终纤维素向纤维素纳米晶的转化。这是因为纤维素酶催化β-1,4
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d糖苷键的裂解需要水分子的参与；充足的水可以催化糖苷键的裂解，而微量的液体可能会影响内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的催化性能，如发生逆反应，导致水解产物比例的变化，以提高纤维素纳米晶的产率。
32.实施例11将10.00 g通过实施例3制备得到的竹浆纯化纤维素，0.1514 g里氏木霉纤维素
酶，5.000 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，3h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为42.65%。
33.实施例12将10.00 g通过实施例5制备得到的漂白木浆纯化纤维素，0.1514 g康氏木霉纤维素酶，5.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为30 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，3h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为48.93%。
34.实施例13将10.00 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，0.1514 g绿色木霉纤维素酶，5.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为50 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，3h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为42.59%。
35.实施例14将10.00 g通过实施例6制备得到的棉浆纯化纤维素，0.1514 g热纤梭菌纤维素酶，5.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，2h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为45.81%。
36.实施例15将10.00 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，0.1514 g长柄木纤维素酶，5.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，4 h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为49.34%。
37.实施例16
将10.00 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，0.1514 g绿色木霉纤维素酶，5.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为35 ℃，三区温度为40 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，4 h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为40.21%。
38.实施例17将10.00 g通过实施例2制备得到的玉米芯纯化纤维素，0.1514 g里氏木霉纤维素酶，5.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定双螺杆挤出机的一区温度为30 ℃，二区温度为35 ℃，三区温度为40 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，4 h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为38.91%。
39.实施例18将10.00 通过实施例2制备得到的玉米芯纯化纤维素，0.1514 g黑曲霉纤维素酶，5.00 ml，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，制备成物理混合物；设定挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为30 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入物理混合物，经挤出机的融熔、剪切、输送，4 h后得到条状挤出物；待挤出物冷却后，取0.300 g挤出物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为47.32%。
40.实施例 19将10.00 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，0.1514 g长柄木霉纤维素酶，200 ml ，ph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液投入500 ml圆底烧瓶中，并在50℃水浴中反应72h，在的稀悬浮液（5％，w/v）中进行72 h。反应结束后，取0.300 g混合物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为5.86%，与实施例9方法比较，一种连续式酶催化制备纤维素纳米晶的方法所需反应溶剂小，生产效率高。
41.实施例 20设定双螺杆挤出机的一区温度为25 ℃，二区温度为30 ℃，三区温度为35 ℃，待温度上升至设定值后，设定螺杆转速为40 rpm/min，待速度稳定后投入10 g通过实施例1制备得到的稻草秸秆纯化纤维素，经挤出机的融熔、剪切、输送，3h后得到挤出物，转移至圆底烧瓶，加入0.1514g长柄木霉纤维素酶，以及200 mlph为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，反应72 h；反应结束后，取0.300 g混合物，加入30 ml纯净水，溶解至无明显颗粒，混悬液以11000 rpm离心，重复操作，直至上清液呈中性，沉淀再经过溶解后，以2500 rpm离心，上清液为纤维素纳米晶混悬液，经冷冻干燥得到纤维素纳米晶粉末，产率为20.86%，与实施例9
方法比较，可以发现机械力与酶催化的协同作用大大提高了生产效率。
42.本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。本领域内的普通技术人员可以对上述说明加以修改或增进，这些修改或增进都应属于本发明权利要求的保护范围内。