一种癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针及其制备方法和用途

1.本发明涉及一种癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针及其制备方法和用途，以实现对癌细胞线粒体内硝基还原酶的检测。


背景技术：

2.癌症已经成为导致人类死亡的重要原因之一。目前临床上治疗癌症最有效的手段为手术切除，然而如何精确识别肿瘤与正常组织的边界成为困扰临床医生的难题，因此发展用于肿瘤精确识别的方法具有重要意义。为了实现更精准的肿瘤切除，荧光引导手术逐渐成为外科医生的“宠儿”。该技术利用特定波长激发光照射，激发肿瘤自身荧光、滞留的荧光分子或细胞摄取的外源性荧光物质发出荧光，引导术者对肿瘤进行精准切除。靶向荧光探针能够特异性点亮病变细胞，帮助医生发现容易疏漏的病变，提高早癌的检出率。
3.缺氧是肿瘤细胞的重要特点之一。在一些实体瘤中氧气浓度低，局部甚至低至0%。硝基还原酶，一种黄素蛋白酶，是缺氧肿瘤细胞中高表达的内源性还原酶，其表达程度的高低与肿瘤缺氧程度密切相关。硝基还原酶作为一种还原酶，在nadh/nadph作为氢供体存在的情况下，可以将含硝基的芳香衍生物还原为相应的羟胺或氨基衍生物。
4.硝基还原酶水平上调被认为是缺氧的标志，也是肿瘤标志物。发展能够用于检测硝基还原酶在缺氧肿瘤中的表达情况的方法具有重要意义。
5.2021年10月29日中国专利cn2021109793780公开了检测硝基还原酶的双光子荧光探针及其制备方法和用途。
6.在硝基还原酶的研究中，荧光探针因其操作简单、灵敏度高和无与伦比的时空分辨率而受到广泛关注。到目前为止，已有许多“关-开”荧光探针用于检测硝基还原酶和肿瘤缺氧程度的报道。不幸的是，大多数探针发射在紫外和可见光谱范围，即650nm以下，受到背景自荧光和组织穿透深度能力弱的困扰。且目前报道的硝基还原酶荧光探针大都不具备癌细胞靶向，不能区分癌细胞和正常细胞，一般对所有细胞都有响应。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，且具有癌细胞靶向的硝基还原酶响应的荧光探针具有重要的意义。作为本领域技术人员，亟待开发一种癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针及其制备方法和用途。


技术实现要素：

7.本发明旨在提供一种癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以特异性靶向癌细胞并定位于线粒体，且具有可以响应硝基还原酶的有机小分子结构，以实现通过荧光成像实时监测癌细胞线粒体内硝基还原酶的变化，具有癌细胞和线粒体双靶向、选择性高、灵敏度高、光稳定性好等优点，细胞毒性测试表明本发明荧光探针的细胞相容性良好。
8.本发明癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针，以下简记为bno2，其
结构式如下：。
9.bno2中生物素部分具有癌细胞靶向性，吡啶盐结构具有线粒体靶向性，对硝基苯甲醚结构作为硝基还原酶响应位点，参见附图9。
10.本发明癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：步骤1：将dmf（90ml）混溶于二氯甲烷（300ml）中，氮气保护下冰浴搅拌降温至-5℃，向其中滴加三溴化磷（72ml），滴加完毕于0℃搅拌反应2小时后向其中滴加环己酮（40ml），滴加完毕移至室温反应10小时。反应结束后，将反应液缓慢滴加入800ml冰水混合物中，再用碳酸钠调节混合液至ph=7，过程中冰浴维持温度小于0℃，用ch2cl2（500ml)萃取3次，合并有机相用无水na2so4干燥并浓缩，得到46g棕色油状粗产物1，记为化合物1。
11.步骤2：将dmf（250ml）加入化合物1（46g）中，搅拌状态下向其中依次加入2-羟基-4-甲氧基苯甲醛（26g）、碳酸钾（84.6g）。室温搅拌24小时。反应结束，过滤除去不溶物。减压蒸出dmf，用ch2cl2（500ml)萃取3次，合并有机相用无水na2so4干燥并浓缩得到油状产物，向其中加入乙酸乙酯（50ml）石油醚（200ml）室温打浆5小时，过滤、干燥得到29g黄色固体粉末2，记为化合物2。
12.步骤3：将化合物2（5.6g)溶于二氯甲烷（30ml），氮气保护下冰浴降温至0℃，向其中缓慢滴加三溴化硼（13.3g），滴加完毕0℃下反应1小时后移至室温反应12小时。反应结束后冰浴下向反应体系中缓慢滴加水（10ml）搅拌1小时淬灭，再向其中加入甲醇（60ml）溶解，减压浓缩得到棕黄色固体，向黄色固体中加入甲醇（30ml），搅拌状态向上述甲醇溶液中缓慢滴加水（120ml）搅拌6小时，过滤、烘干得到5.1g黄色固体粉末3，记为化合物3。
13.步骤4：将化合物3（5.1g)、对硝基溴苄（5.8g)、碳酸钾（4.6g）溶于dmf（20ml）中室温搅拌8小时，反应结束后搅拌状态下向反应体系中缓慢滴加水（120ml）搅拌3小时，过滤、干燥得到黄色固体粉末，再经石油醚：乙酸乙酯=8:1（体积比)作为洗脱剂，过柱纯化得到6.2g黄色固体粉末4，记为化合物4。
14.步骤5：将n-boc-3-氨基丙基溴（5g）溶于4-甲基吡啶（20ml）中，氮气保护下于80℃搅拌反应24小时，反应结束后室温搅拌下向其中缓慢滴加石油醚150ml搅拌1小时，分出体系中的液体，得到油状粗产物，再经二氯甲烷：甲醇=50:1（体积比)作为洗脱剂，过柱纯化得到6.5g淡黄色油状产物5，记为化合物5。
15.步骤6：将化合物5（2g）、化合物4（2.4g）溶于乙醇（20ml）中，搅拌状态下向其中加入哌啶（0.5g），加热回流反应12小时。反应结束后减压蒸干反应液得到深紫色油状物，再经二氯甲烷：甲醇=50:1（体积比)作为洗脱剂，过柱纯化得到3.3g深紫色固体6，记为化合物6。
16.步骤7：将化合物6（1g）溶于盐酸的乙醇溶液中（40ml，2m），室温搅拌，通过tlc监
控，当化合物6反应完全后，将反应体系减压浓缩得到深紫色固体，加入dmf（2ml）溶解，向其中加入三乙胺（0.6g）、d-生物素（433mg）、hatu（674mg）室温搅拌2小时，反应结束搅拌状态下向反应液中缓慢滴加水（20ml），过滤烘干得到深紫色固体，再经二氯甲烷：甲醇=15:1（体积比)作为洗脱剂，过柱纯化得到732mg深紫色固体即为荧光探针bno2。
17.本发明癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针的合成过程如下：d-生物素，d-biotin，为b族维生素之一；dmf是n，n-二甲基甲酰胺的简称，dcm是二氯甲烷的简称。
18.本发明癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针的用途，是在检测癌细胞线粒体内硝基还原酶变化时作为检测试剂使用。检测方法如下：将探针bno2用二甲基亚砜配置成2mm的储备液，硝基还原酶用ph7.4的pbs缓冲溶液配制成200μg/ml的储备液，nadh用ph7.4的pbs缓冲溶液配制成300
µ
m的储备液。在浓度为10
µ
m的探针bno2的pbs溶液（3ml）中，加入硝基还原酶5μg后，探针的最大吸收位置由488nm红移到了534nm，并且吸收强度增加。在加入硝基还原酶之前，探针bno2几乎不发荧光，而加入5μg的硝基还原酶之后，探针在665nm处发射出强的荧光。随后对探针bno2在含nadh的pbs缓冲液中与硝基还原酶发生的反应进行动力学光谱扫描，实验结果表明，探针可以对硝基还原酶实现高灵敏度响应。在浓度为10μm的探针bno2的pbs溶液中，伴随加入的硝基还原酶浓度的增加（浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0ug/ml)，探针在
665nm处荧光强度逐渐增加，在665nm处的荧光强度与硝基还原酶的浓度成良好的线性关系（r2=0.99）。
19.在浓度为10μm的探针bno2的pbs溶液中，加入常见的金属离子，活性氧及氨基酸等物质，考察探针对硝基还原酶的选择性。如图4所示，在加入上述物质后，探针在665nm处的荧光几乎没有增强，说明探针对硝基还原酶具有高的选择性。
20.本发明具有以下有益效果：本发明癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针，在溶液和细胞中都对硝基还原酶有良好响应能力，细胞毒性测试表明探针的细胞相容性良好，共聚焦荧光显微成像实验表明探针可以有效定位线粒体（定位系数为0.85），适用于线粒体荧光成像和原位检测，可以原位检测缺氧诱导癌细胞线粒体中硝基还原酶的变化趋势。
21.为了确定该探针的肿瘤敏感性和亲和力，将bno2与生物素受体阳性的细胞（hela、hepg2、a549细胞）和受体阴性的细胞（3t3、293t、mh-s细胞）孵育。如图8所示，生物素受体阳性的hela、hepg2和a549细胞在bno2孵育后显示出较强的荧光信号。然而，在3t3、293t、mh-s细胞中只观察到较弱的荧光信号。这些细胞系之间的差异可能是由于癌细胞表面生物素受体的表达高于正常细胞，这有助于hela、hepg2和a549细胞通过受体介导的内吞作用选择性地摄取bno2。这一结果表明，探针bno2对生物素受体阳性癌细胞具有潜在的靶向能力。
附图说明
22.图1是探针bno2在含nadh（300
µ
m）的pbs缓冲液中与硝基还原酶（10μg）发生反应的动力学光谱扫描图；图2是实施例1探针bno2吸收谱图和荧光发射谱图，其中图2（a）为硝基还原酶加入前后探针bno2的吸收光谱图，图2（b）为在为加入硝基还原酶前后探针bno2的荧光发射光谱图；图3是探针bno2与不同浓度的硝基还原酶发生反应时的荧光发射图，其中，图3a为探针在665nm处荧光强度逐渐增加；图3b为探针在665nm处的荧光强度与硝基还原酶的浓度之间的线性关系图；图4是探针bno2的选择性示意图，其中，纵坐标为探针bno2在665nm处的荧光强度，横坐标物质的顺序为1.nacl；2.kcl；3.nahs；4.nahso3；5.cucl2；6.mgso4；7.h2o2；8.h2o2；9.gsh；10.hcy；11.cys；12.glu；13.arg；14.ser；15.硝基还原酶（5μg/ml）和nadh（300μm)；图5是在不同浓度（0μm、10μm、20μm和30μm）的探针bno2的作用下的hela细胞存活率图；图6是bno2（10μm）和0.5μm商用线粒体探针（mitotrackergreenfm）同时共染hela细胞线粒体共聚焦荧光成像图。探究bno2的线粒体靶向能力；图7是探针bno2在hela细胞中的共聚焦成像图，其中图7a为常氧下hela细胞成像图，图7b为缺氧下hela细胞成像图。brightfield为对应的明场照片；图8是探针bno2在hela细胞、hepg2细胞、a549细胞和3t3细胞、293t细胞、mh-s细胞中的硝基还原酶荧光成像，其中（a）是孵育结束后经pbs清洗后成像，（b）从图像中定量的相对荧光强度，以a标尺为单位：20μm；图9是bno2中的各部分结构功能示意图。
具体实施方式
23.下面用具体实施例说明本发明，但并不是对本发明的限制。
24.实施例1bno2的合成：
将化合物6（1g）溶于盐酸的乙醇溶液中（40ml，2m），室温25℃搅拌，通过tlc监控，当化合物6反应完全后，将反应体系减压浓缩得到深紫色固体，加入dmf（2ml）溶解，向其中加入三乙胺（0.6g）、d－生物素（433mg）、hatu（674mg）室温25℃搅拌2小时，反应结束搅拌状态下向反应液中缓慢滴加水（20ml），过滤烘干得到深紫色固体，再经二氯甲烷：甲醇=15:1（体积比）作为洗脱剂，过柱纯化得到732mg深紫色固体即为癌细胞靶向的响应线粒体内硝基还原酶的荧光探针，标记简称为bno2，产率为62%。1hnmr（400mhz，dmso-d6)δ8.65（d，j=6.7hz，1h)，8.25（d，j=8.8hz，1h)，8.20（d，j=15.8hz，1h)，8.03（d，j=6.7hz，1h)，7.87（t，j=5.7hz，1h)，7.70（d，j=8.8hz，1h)，7.21（d，j=8.5hz，0h)，7.07（d，j=2.7hz，0h)，6.79（dd，j=8.5，2.5hz，1h)，6.75（s，1h)，6.61（d，j=15.7hz，1h)，6.34（d，j=16.1hz，1h)，5.31（s，1h)，4.37（t，j=7.0hz，1h)，4.26（dd，j=7.8，5.0hz，1h)，4.08（ddd，j=7.7，4.5，1.9hz，1h)，3.05（q，j=6.4hz，2h)，2.77（dd，j=12.4，5.1hz，1h)，2.61
–
2.50（m，1h)，2.01（dt，j=19.4，7.1hz，2h)，1.77
–
1.67（m，1h)，1.62
–
1.38（m，2h)，1.31
–
1.17（m，1h).esi-msm/z:calcd.forc
40h44
n5o6s
+
，bno2，722.3007，found，722.2980步骤1：将dmf（90ml）混溶于二氯甲烷（300ml）中，氮气保护下冰浴搅拌降温至-5℃，向其中滴加三溴化磷（72ml），滴加完毕于0℃搅拌反应2小时后向其中滴加环己酮（40ml），滴加完毕移至室温25℃反应10小时。反应结束后，将反应液缓慢滴加入800ml冰水混合物中，再用碳酸钠调节混合液至ph=7，过程中冰浴维持温度小于0℃，用ch2cl2（500ml)萃取3次，合并有机相用无水na2so4干燥并浓缩，得到46g棕色油状粗产物1，记为化合物1。
25.步骤2：将dmf（250ml）加入化合物1（46g）中，搅拌状态下向其中依次加入2-羟基-4-甲氧基苯甲醛（26g）、碳酸钾（84.6g）。室温25℃搅拌24小时。反应结束，过滤除去不溶物。减压蒸出dmf，用ch2cl2（500ml)萃取3次，合并有机相用无水na2so4干燥并浓缩得到油状产物，向其中加入乙酸乙酯（50ml）石油醚（200ml）室温25℃打浆5小时，过滤、干燥得到29g黄色固体粉末2，记为化合物2。
26.步骤3：将化合物2（5.6g)溶于二氯甲烷（30ml），氮气保护下冰浴降温至0℃，向其中缓慢滴加三溴化硼（13.3g），滴加完毕0℃下反应1小时后移至室温25℃反应12小时。反应结束后冰浴下向反应体系中缓慢滴加水（10ml）搅拌1小时淬灭，再向其中加入甲醇（60ml）溶解，减压浓缩得到棕黄色固体，向黄色固体中加入甲醇（30ml），搅拌状态向上述甲醇溶液中缓慢滴加水（120ml）搅拌6小时，过滤、烘干得到5.1g黄色固体粉末3，产率为96%，记为化合物3。
27.步骤4：将化合物3（5.1g)、对硝基溴苄（5.8g)、碳酸钾（4.6g）溶于dmf（20ml）中室温25℃搅拌8小时，反应结束后搅拌状态下向反应体系中缓慢滴加水（120ml）搅拌3小时，过滤、干燥得到黄色固体粉末，再经石油醚：乙酸乙酯=8:1（体积比)作为洗脱剂，过柱纯化得到6.2g黄色固体粉末4，产率为76%，记为化合物4。
28.步骤5：将n-boc-3-氨基丙基溴（5g）溶于4-甲基吡啶（20ml）中，氮气保护下于80℃搅拌反应24小时，反应结束后室温25℃搅拌下向其中缓慢滴加石油醚150ml搅拌1小时，分出体系中的液体，得到油状粗产物，再经二氯甲烷：甲醇=50:1（体积比)作为洗脱剂，过柱纯化得到6.5g淡黄色油状产物5，产率为94%，记为化合物5。
29.步骤6：将化合物5（2g）、化合物4（2.4g）溶于乙醇（20ml）中，搅拌状态下向其中加入哌啶（0.5g），加热回流反应12小时。反应结束后减压蒸干反应液得到深紫色油状物，再经
二氯甲烷：甲醇=50:1（体积比)作为洗脱剂，过柱纯化得到3.3g深紫色固体6，产率为80%，记为化合物6。
30.注：1、bno2的光谱测试：将探针bno2用二甲基亚砜配置成2mm的储备液，硝基还原酶用ph7.4的pbs缓冲溶:液配制成200μg/ml的储备液，nadh用ph7.4的pbs缓冲溶液配制成300
µ
m的储备液。在浓度为10
µ
m的探针bno2的pbs溶液（3ml）中，加入硝基还原酶5μg后，探针的最大吸收位置由488nm红移到了534nm，并且吸收强度增加见图2（a）。在加入硝基还原酶之前，探针bno2几乎不发荧光，而加入5μg的硝基还原酶之后，探针在665nm处发射出强的荧光，见图2（b）。探针bno2在含nadh（300
µ
m）的pbs缓冲液中与硝基还原酶（10μg）发生反应的动力学光谱扫描，见图1，实验结果表明，探针可以对硝基还原酶实现高灵敏度响应。在浓度为10μm的探针bno2的pbs溶液中，伴随加入的硝基还原酶浓度的增加（浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/ml)，探针在665nm处荧光强度逐渐增加（图3a），在665nm处的荧光强度与硝基还原酶的浓度成良好的线性关系（r2=0.99）（图3b）。为了检验探针bno2的选择性，干扰物包括nacl、kcl、nahs、nahso3、cucl2、mgso4、h2o2、h2o2、gsh、hcy、cys、glu、arg、ser，用pbs溶液配制含有不同干扰物的溶液，干扰物的物质的量浓度为2.0
×
10-4
mol
·
l-1
，探针bno2最终的物质的量浓度为1.0
×
10-5
mol
·
l-1
。
31.随后将探针bno2加入以含nadh（300μm）和硝基还原酶ntr（5μg/ml）的pbs溶液中制成硝基还原酶对照组。如图4所示，可以看出，探针bno2在各种离子和氨基酸的干扰实验中荧光较弱，而硝基还原酶对照组荧光强度明显高于其他含有干扰物体系样品的荧光强度，这证明了探针bno2在复杂环境中仍然对硝基还原酶（ntr）具有很好的选择性。
32.2、细胞毒性测试：在探针bno2进行细胞成像的应用之前，需要对探针的毒性进行测试，采用mtt法进行实验。分别加入0μm、10μm、20μm和30μm的探针bno2培养hela细胞24h，发现细胞存活率始终保持在90%以上，见图5。因而探针bno2对于hela细胞的毒性较低，可以进行生物应用。
33.3、细胞定位测试：为了研究bno2的线粒体定位性能，这里使用线粒体的商业染料（mitotrackergreen fm，0.5 μm）与（bno2，10μm）在hela细胞中进行共定位研究。结果表明bno2的红色通道（λ
em
= 534nm，λ
ex
=665 nm）见图6（a）和mitotracker green fm（λ
em
=523nm，λ
ex
=490nm）（图6b）的荧光图像重叠良好，见图6（c），并且bno2与mitotrackergreenfm的pearson共定位系数计算为0.85，见图6（d）。这些结果表明，bno2可以很好地定位于活细胞的线粒体中。
34.4、bno2对缺氧诱导的硝基还原酶的成像：通过控制氧含量达到低氧条件，用bno2探针检测低氧细胞ntr水平。在常氧条件下，处理的hepg2细胞几乎没有荧光，见图7（b），在低氧（1%o
2）
条件下，bno2处理后的细胞发出明显的近红外荧光信号，见图7（b）。表明bno2能在低氧环境中特异性地捕获内源性酶ntr。
35.5、bno2对癌细胞特异性实验：分别向hela细胞、hepg2细胞、a549细胞、3t3细胞、293t细胞、mh-s细胞培养基中加入5μl浓度为2mm探针bno2的dmso溶液，于37℃恒温状态培养1小时。孵育结束后经pbs清洗后成像见图8（a）。