一种哈茨木霉微生物菌剂的固体发酵方法与流程

1.本发明属于农业微生物菌剂技术领域，具体涉及一种哈茨木霉微生物菌剂的固体发酵方法。


背景技术：

2.稳定和高效生物治理手段尤为重要，微生物作为地球生命活动最重要的参与者之一，在土壤、动植物体起着极其关键的介导作用。在农业种植过程中，无机化肥和合成农药的过度使用，已经造成我国土壤板结、贫瘠、酸碱化、营养流失、重金属超标和药害残留等严重问题，而且随着全球资源紧缺、生态形势恶劣和国际矛盾激化，我国亟需积累和拥有自己有效的核心生防治理方案。
3.哈茨木霉(trichoderma harzianum)作为一种具有较强生物防治(拮抗病原菌)的真菌型有益微生物，在我们农业生产上，对土壤改良与修复、预防植物病害等方面有着重要的作用，而且能够有效分解土壤有机物转化为清洁能源，对我国“碳中和”“碳达峰”起着重要贡献力。市面上存在许多种类的哈茨木霉，但基本上普遍存在菌种混乱、功能不强、杂菌率高、和发酵水平低等突出的问题，对工业化生产造成了巨大的阻碍。因此，获得优良的生防菌种、简易化操作程序和高水平发酵工艺对我国提高工业集约化生产和促进农业经济发展有很大的帮助。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种哈茨木霉微生物菌剂的固体发酵方法。本发明提供的哈茨木霉微生物菌剂的固体发酵方法，有效解决了生防菌株在工业生产上固体发酵难度大的问题，通过提供的哈茨木霉bwt1.221的固体发酵方法制备的生防微生物菌剂菌体数量高、细度大、水分适宜和纯菌种发酵优势(杂菌率＜0.01％)，超微粉碎后可过200目网筛(标准《农用微生物菌剂gb20287-2006》中仅规定为过80目网筛)，尤其发酵条件简单易操作，其固体发酵方法为工业化生产微生物菌剂提供了有力的理论基础和实践经验。
5.本发明是通过以下技术方案实施的：
6.首先，从发病和健康番茄植株根际土壤中定向分离获得若干真菌菌株，通过平板对峙法和液体发酵筛选获得具有拮抗常见病原菌的功能菌株，该菌株具备生长速度快的功能特性，经16s rdna鉴定菌株，最终获得生防菌株哈茨木霉bwt1.221。所述哈茨木霉(trichoderma harzianum)bwt1.221于2022年9月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼 ，菌种保藏号为gdmcc no:62833。
7.更进一步地，所述的哈茨木霉bwt1.221具有拮抗腐皮镰刀菌、炭疽菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、禾谷镰孢菌等植物病原菌的生防功能，通过平板对峙实验和测定拮抗菌落直径，哈茨木霉bwt1.221对上述植物病原菌的抑制率为50％～65％。
8.进一步地，为了有效解决生防菌株在工业生产上固体发酵难度大的问题，本发明通过对哈茨木霉bwt1.221的固体发酵方法中的固体发酵条件进行优化实验，主要优化内容包括物料成分、物料比例、料水比、速效碳源、速效氮源、响应面正交试验、发酵温度和发酵时间，最终获得生防菌株哈茨木霉bwt1.221最佳的固体发酵方案。最终制得的生防微生物菌剂菌体数量高、细度大、水分适宜和纯菌种发酵优势(杂菌率＜0.01％)。
9.本发明的具体技术方案为：
10.本发明提供的哈茨木霉微生物菌剂的固体发酵方法，包括如下步骤：
11.s1、将哈茨木霉bwt1.221接种于pda培养基，进行菌种活化；
12.s2、将步骤s1得到的活化后的哈茨木霉分别接种于pda固体培养基和pdb液体培养基中，进行培养；
13.s3、将步骤s2所得的培养后的菌种接种于固体发酵培养基中，进行菌种固体发酵培养，然后烘干、粉碎，即得哈茨木霉微生物菌剂。
14.优选地，所述步骤s3中的固体发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：
15.(1)将固体发酵基质、蔗糖、尿素、硫酸铵和水混合均匀，得固体发酵基础培养基；所述固体发酵基质、蔗糖、尿素和硫酸铵之和与水的重量比1:0.7；所述固体发酵基质为麸皮和玉米粉按重量比0.25:1组成；所述蔗糖、尿素和硫酸铵的添加量为固体发酵基础培养基重量的5％、0.15％和0.8％；
16.(2)将步骤(1)所得的固体发酵基础培养基与废弃果渣、废弃果汁混合均匀，高温灭菌，即得固体发酵培养基。
17.优选地，所述废弃果渣和废弃果汁的制备方法为：将废弃菠萝、甘蔗和薯叶按重量比1：1：1进行混合搅碎，充分打碎后获得混合果蔬残渣剩汁，使用离心机进行沉淀分离，即得废弃果渣和废弃果汁。
18.优选地，所述步骤(2)中固体发酵基础培养基与废弃果渣、废弃果汁的重量比为10:1:0.2，所述高温灭菌的条件为121℃，30min。
19.本发明通过在固体发酵培养基中加入废弃菠萝、甘蔗和薯叶后，由于该类生物质材料富含纤维素、维生素和多糖类物质，碳氮基营养丰富，且微孔径大、质地疏松，有利的为微生物提供生存空间，所制得的哈茨木霉微生物菌剂有效活菌数、分生孢子数和孢子产出率大大提高，为工业化生产应用提供一种哈茨木霉的高产孢子方法。
20.优选地，所述步骤s1和s2中的pda固体培养基，由如下组分组成：马铃薯浸提粉300g，葡萄糖20g，琼脂粉16～20g，水1l；
21.所述s2中的pdb液体培养基，由如下组分组成：马铃薯浸提粉300g，葡萄糖20g，水1l。
22.优选地，所述步骤s1中，菌种活化的过程为：将哈茨木霉bwt1.221接种于pda培养基中，于26～30℃恒温培养箱静置培养72h。
23.优选地，所述步骤s2的培养过程为：将步骤s1得到的活化后的哈茨木霉接种于固体平板(pda固体培养基)及三角瓶液体(pdb液体培养基)中，接种量为1％，于28℃的恒温培养箱固体培养或200rpm的恒温摇床中液体培养3～5d。
24.优选地，所述步骤s3中的固体发酵培养时的接种量为5％，发酵温度为28℃，培养时间为7d，在28℃的条件下烘干24h后粉碎，获得哈茨木霉微生物菌剂。
25.优选地，所述步骤s3中所得的哈茨木霉微生物菌剂细度可通过200目网筛(0.074mm孔径)。
26.优选地，所述步骤s3中所得的哈茨木霉微生物菌剂的含水率为12.87％，有效活菌数为12.91
×
109cfu/g，分生孢子数为12.38
×
109cfu/g，孢子产出率达95.9％。较未添加废弃菠萝、甘蔗和薯叶制得的废弃果渣和废弃果汁的固体发酵基础培养基发酵的哈茨木霉微生物菌剂的有效活菌数提高228％，分生孢子数提高301％，孢子产出率提高22.3％。
27.本发明的哈茨木霉bwt1.221是根据严格的分离筛选程序，通过平板对峙实验、液体高密度发酵和固体发酵条件优化获得最优良的生防菌种，对常见病原菌炭疽菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌等有着很强的抑制拮抗作用，可经诱导、寄生、侵占、绞杀等生防方式对病原体进行抑制和消灭。利用本发明简单、方便操作的固体发酵工艺制备的哈茨木霉bwt1.221微生物菌剂，有着菌体数高、细度大、水分适宜和纯菌种发酵等特点，在土壤生态修复和植物病虫害防治上起到突出的生物防治效果。
28.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
29.(1)本发明提供的哈茨木霉的固体发酵方法，有效解决了生防菌株在工业生产上固体发酵难度大的问题，市面上的此类菌株种类缺乏、菌种筛选功能弱、鉴定不准确，污染严重，而本发明通过哈茨木霉bwt1.221制备的生防微生物菌剂菌体数量高、细度大、水分适宜和纯菌种发酵优势(杂菌率＜0.01％)，超微粉碎后可过200目网筛(标准《农用微生物菌剂gb20287-2006》中仅规定为过80目网筛)，尤其发酵条件简单易操作，其固体发酵方法为工业化生产微生物菌剂提供了有力的理论基础和实践经验。
30.(2)本发明对农业固体有机废弃物进行了充分的资源化利用，添加农业废弃果蔬残渣汁进行固体发酵条件优化后，所制备的农用微生物菌剂有效活菌数、分生孢子数和孢子产出率大大提高，为工业化生产应用提供一种哈茨木霉的高产孢子方法。
附图说明
31.图1为实施例1的哈茨木霉微生物菌剂成品状态。
32.图2为实施例1的哈茨木霉bwt1.221固体发酵湿润状态。
33.图3为不同物料成分对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响。
34.图4为不同物料比例对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响。
35.图5为不同料水比对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响。
36.图6速效碳源蔗糖对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响。
37.图7速效氮源对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响。
38.图8不同发酵温度对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响。
39.图9不同发酵时间对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响。
40.注：图3～图9在同一系列下进行显著性方差分析，不同字母之间代表存在差异性显著(p＜0.05)。
具体实施方式
41.以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本
发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
42.以下实施例中，未作特别说明的试剂为常规试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。
43.实施例1一种哈茨木霉微生物菌剂的固体发酵方法
44.所述的哈茨木霉微生物菌剂的固体发酵方法，包括如下步骤：
45.s1、将哈茨木霉bwt1.221接种于pda培养基中，于28℃的恒温培养箱静置培养72h，进行菌种活化；
46.s2、将步骤s1得到的活化后的哈茨木霉分别接种于pda固体培养基和pdb液体培养基中，接种量为1％，于28℃的恒温培养箱固体培养或200rpm恒温摇床中液体培养3～5d；
47.所述pda固体培养基，由如下组分组成：马铃薯浸提粉300g，葡萄糖20g，琼脂粉16～20g，水1l；
48.所述pdb液体培养基，由如下组分组成：马铃薯浸提粉300g，葡萄糖20g，水1l。
49.s3、将步骤s2所得的培养后的菌种接种于固体发酵培养基中，接种量为5％，并且在发酵温度为28℃的条件下，培养7d，在28℃烘干条件下烘干24h后粉碎，即得哈茨木霉微生物菌剂。
50.所述固体发酵培养基的制备方法，包括如下步骤：
51.(1)将固体发酵基质、蔗糖、尿素、硫酸铵和水混合均匀，得固体发酵基础培养基；所述固体发酵基质、蔗糖、尿素和硫酸铵之和与水的重量比1:0.7；所述固体发酵基质为麸皮和玉米粉按重量比0.25:1组成；所述蔗糖、尿素和硫酸铵的添加量为固体发酵基础培养基重量的5％、0.15％和0.8％。
52.(2)将步骤(1)所得的固体发酵基础培养基与废弃果渣、废弃果汁按重量比10:1:0.2混合均匀，121℃，30min进行高温灭菌，冷却后即得固体发酵培养基。
53.所述废弃果渣和废弃果汁的制备方法为：将废弃菠萝、甘蔗和薯叶按重量比1：1：1进行混合搅碎，充分打碎后获得混合果蔬残渣剩汁，使用离心机进行沉淀分离，即得废弃果渣和废弃果汁。
54.所述步骤s3中所得的哈茨木霉微生物菌剂细度可通过200目网筛(0.074mm孔径)。
55.所述步骤s3中所得的哈茨木霉微生物菌剂的含水率为12.87％，有效活菌数为12.91
×
109cfu/g，分生孢子数为12.38
×
109cfu/g，孢子产出率达95.9％。
56.实施例1所制得的哈茨木霉微生物菌剂成品状态如图1所示，实施例1步骤3未烘干前的哈茨木霉bwt1.221固体发酵湿润状态如图2所示图。
57.试验例1哈茨木霉bwt1.221对不同植物病原菌的抑制效果
58.通过平板对峙实验，结果表明哈茨木霉bwt1.221对常见的植物病原菌腐皮镰刀菌、炭疽菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、禾谷镰孢菌均具有抑制效果，经病原菌直径测量和抑制率计算(如表1所示)，总体抑制率为50～65％，其中哈茨木霉bwt1.221对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抑制效果最好(与其他病原菌均达差异性显著p＜0.05)，分别达60.87％和61.06％，对禾谷镰孢菌抑制效果稍微差一些。
59.表1哈茨木霉bwt1.221对不同植物病原菌的生长影响及抑制作用
[0060][0061]
注：不同小写字母表示在p＝0.05水平差异性显著。
[0062]
试验例2不同物料成分对哈茨木霉固体发酵有效活菌数的影响
[0063]
选取不同物料成分，其比例均按1:1混合进行固体发酵，如图3所示，结果表明麸皮和玉米粉混合物发酵效果最佳，湿重和干重有效活菌数分别为3.19
×
109cfu/g和3.34
×
109cfu/g(与其他物料成分均达差异性显著p＜0.05)，菌体存活率为61.59％；发酵效果最差的为单种物料麸皮，湿重和干重有效活菌数分别为0.87
×
109cfu/g和1.05
×
109cfu/g，但菌体存活率最高，为71.27％。由于单种麸皮物料营养不高，导致菌体数偏低，而其堆积时疏松透水，后期继续缓慢生长，菌体存活率较高。麸皮和玉米粉物料粗细混合，搭配适当，营养充分，使得哈茨木霉bwt1.221能够长透整个三角瓶，因此是工厂化固体发酵比较合适的原料。
[0064]
试验例3不同物料比例对哈茨木霉固体发酵有效活菌数的影响
[0065]
本实验以麸皮和玉米粉作为基础发酵物料，通过不同物料比例进行哈茨木霉固体发酵。如图4所示，结果表明在麸皮：玉米粉＝0.25:1的比例下发酵效果最佳，湿重和干重有效活菌数分别为4.00
×
109cfu/g和4.28
×
109cfu/g(与其他物料比例均达差异性显著p＜0.05)，菌体存活率为62.94％；随着麸皮和玉米粉比例加大，发酵效果越差。玉米粉的营养价值比麸皮更高，麸皮提供一定的生长空隙，提高透气性和透水性，充足的生长空间和透气性使得哈茨木霉bwt1.221在麸皮和玉米粉比例为0.25:1时发酵菌体数量最高。
[0066]
试验例4不同料水比对哈茨木霉固体发酵有效活菌数的影响
[0067]
在哈茨木霉的固体发酵过程中，合适的料水比起着至关重要的作用，过干过湿对发酵菌数和存活率都有很大的影响。实验结果表明(如图5所示)，当料水比为1:0.7时发酵菌数最高，湿重和干重有效活菌数分别为4.23
×
109cfu/g和4.51
×
109cfu/g(与料水比为1:0.8时差异不显著(p＞0.05)，但与其他料水比均达差异性显著p＜0.05)，菌体存活率为62.67％；最高存活率为料水比1：0.8时达68.54％。低水分和高水分发酵条件下均对哈茨木霉bwt1.221发酵不利，可能造成物料成团，菌体无法长透到物料里面，从而导致菌体数量低。哈茨木霉bwt1.221固体发酵的最佳料水比为1:0.7。
[0068]
试验例5不同速效碳源(蔗糖)添加量对哈茨木霉固体发酵有效活菌数的影响
[0069]
速效碳源对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响较大。如图6所示，结果表明在一定蔗糖添加量范围内随着添加量的增加菌体数量也不断增加，当蔗糖添加量达到5％时开始缓慢增加，蔗糖添加量5％与6％之间菌体数量变化差异不显著(p＞0.05，但与其他蔗糖添加量均呈差异性显著p＜0.05)，湿重有效活菌数分别为7.97
×
109cfu/g和8.06
×
109cfu/g，干重分别为8.15
×
109cfu/g和8.27
×
109cfu/g，菌体存活率分别为60.18％和60.33％。从图6中可看出，菌体数量成先上升后平缓趋势，菌体存活率呈下降趋势，这说明当蔗糖添加量
达到5％左右发酵程度将达到上限，此时菌体之间空间占位，营养竞争，水分和空间的有限很容易造成菌体死亡。因此，建议在工业生产中采用蔗糖添加量为5％进行固体发酵。试验例6不同速效氮源(尿素和硫酸铵)添加量对哈茨木霉固体发酵有效活菌数的影响
[0070]
本实验研究了速效氮源尿素和硫酸铵添加对哈茨木霉bwt1.221固体发酵的影响。结果表明(如图7所示)，菌体数量变化均随尿素和硫酸铵添加量增加而呈先升高后下降趋势。其中尿素添加量0.1％和硫酸铵添加量1％发酵效果最佳(与其他尿素或硫酸铵添加量均呈差异性显著p＜0.05)，湿重和干重有效活菌数分别为4.50
×
109cfu/g和4.85
×
109cfu/g(尿素0.1％)，5.87
×
109cfu/g和6.18
×
109cfu/g(硫酸铵1％)，菌体存活率分别为63.40％和61.93％。当尿素和硫酸铵添加量分别达0.2％、1％后菌体数量和存活率骤降，这说明在一定程度上高浓度速效氮源添加量会抑制哈茨木霉的生长。建议速效氮源尿素和硫酸铵的添加量分别为0.1％和1％。
[0071]
试验例7发酵培养基组分正交试验
[0072]
通过对哈茨木霉bwt1.221发酵培养基中的碳氮源成分进行正交实验，结果表明(如表2所示)，最佳发酵组合为a2b3c1，即蔗糖添加量为5％，尿素添加量为0.15％，硫酸铵添加量为0.8％，菌体数量最高，湿重和干重有效活菌数分别为10.20
×
109cfu/g和10.78
×
109cfu/g，菌体存活率为62.19％。由极差分析可知，影响有效活菌数的主次因素为碳源＞硫酸铵＞尿素。因此，我们应该根据哈茨木霉bwt1.221的营养需求进行添加碳氮源，以备获得最佳菌体有效活菌数量。
[0073]
表2发酵培养基正交试验结果
[0074][0075]
试验例8不同发酵温度对哈茨木霉固体发酵有效活菌数的影响
[0076]
发酵温度是影响哈茨木霉固体发酵的最关键因素之一。实验结果表明(如图8所示)，随着发酵温度的升高，菌体数量和菌体存活率均呈先上升后降低的趋势，28℃时达到最高(与其他温度变化均呈差异性显著p＜0.05)，湿重和干重菌体有效活菌数分别为9.74
×
109cfu/g和10.17
×
109cfu/g，菌体存活率为61.42％。低温和高温对哈茨木霉bwt1.221固体发酵程度的影响巨大，低温菌体生长较慢，分生孢子产生量低，造成菌体数量和存活率均
较低；高温对菌体生长有抑制，由于生存环境产生逆境胁迫，大量菌体死亡，从而导致菌体数量和存活率均较低的现象(由于发酵条件、发酵环境等因素的影响，每次发酵水平有所差异，因此在不同发酵条件下实验数据存在一定的误差)。
[0077]
试验例9不同发酵时间对哈茨木霉固体发酵有效活菌数的影响
[0078]
发酵时间长短也会影响哈茨木霉固体发酵水平。在一定时间范围内，哈茨木霉菌体数量和菌体存活率均呈先升高后下降的趋势，如图9所示，当发酵达到7d后菌体生长状态呈平稳水平，而9d后菌体数量和菌体存活率均降低。在哈茨木霉固体发酵生产应用中，考虑到成本因素，建议7d作为发酵时间。此时哈茨木霉bwt1.221湿重和干重有效活菌数分别为9.83
×
109cfu/g和10.36
×
109cfu/g，菌体存活率为62.00％。
[0079]
试验例10哈茨木霉bwt1.221高产孢子方法
[0080]
根据实例1至实例9中最终优化的固体发酵基础培养基，在其中添加农业固体有机废弃菠萝、甘蔗和薯叶作为添加基质，按废弃果蔬比1：1：1进行混合搅碎，充分打碎后获得混合果蔬残渣剩汁，使用大型离心机进行沉淀分离，分开残渣和残汁，按不同配比与原优化固体发酵基础培养基一起进行121℃，30分钟高温灭菌，冷却后接种哈茨木霉bwt1.221，进行静置固体发酵。
[0081]
ck1：以麸皮和玉米粉为发酵基质的基础培养基；ck2：固体发酵基础培养基；t处理按照以下配比(固体发酵基础培养基：废弃果渣：废弃果汁)进行实验。结果如表3所示。
[0082]
表3哈茨木霉bwt1.221高产孢子固体发酵方法实验处理
[0083][0084]
检测各实验组哈茨木霉bwt1.221有效活菌数和分生孢子数，计算分生孢子产出率，获取最佳哈茨木霉bwt1.221高产分生孢子的配方。
[0085]
结果表明(如表4)，按一定比例添加农业固体废弃菠萝、甘蔗和薯叶残渣汁进行发酵后，哈茨木霉bwt1.221干湿重有效活菌数、分生孢子数及孢子产出率的处理组(t)均与对照组(ck1)呈差异性显著p＜0.05，其中t5固体发酵效果最佳，制备获得微生物菌剂分生孢子数达12.38
×
109cfu/g。
[0086]
表4哈茨木霉bwt1.221高产孢子固体发酵方法菌体数量统计
[0087]
[0088][0089]
注：上述数据分析在同一系列下进行显著性方差分析，不同字母之间代表存在差异性显著(p＜0.05)。
[0090]
表5哈茨木霉bwt1.221高产孢子固体发酵实验组t5与对照组ck1、ck2相比较数据分析
[0091][0092]
实验组t5与对照组ck1与ck2相比较，结果如表5所示，t5与ck1、ck2相比较，干湿重有效活菌数、分生孢子数和孢子产出率均有大幅度提高，其中最终获得的农用微生物菌剂有效活菌数提高228％，分生孢子数提高301％，孢子产出率提高22.3％。
[0093]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。