一种木霉孢子制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种木霉孢子制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]木霉(Trichoderma spp.)属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，粘孢菌类，广泛存在于土壤、空气中，能够生存于从热带到冻土地带的多种生态环境中，是目前为止研究最多的植物生防真菌。大量研究认为，木霉对植物病原菌具有多种拮抗机制，如竞争作用、重寄生作用、酶的溶菌作用、抗生素的产生以及诱导植物产生抗性。大多数木霉，如绿色木霉、哈茨木霉、康宁木霉、绿粘帚霉等木霉菌都具有广谱拮抗作用，能够拮抗的病原真菌包括立枯丝核菌、腐霉菌、疫霉菌、镰刀菌、白絹病菌等，对幼苗立枯病、枯萎病、猝倒病、白絹病等土传病害具有良好的防治效果。另外，木霉菌容易分离和培养，对环境具有较强忍耐能力，因此在植物病生物防治中占有重要地位。
[0003 ]目前国外已有1余个商品化的木霉制剂问世，多为木霉孢子制剂，但木霉菌在植物病害防治中仍然存在很多问题。目前木霉菌剂多为活菌制剂，施用后在土壤中受温度、湿度、PH等因素影响，定殖能力不够理想，难以充分发挥药效，并且木霉菌对植物的促生增产作用不够显著。
[0004]针对以上不足，国内外进行了多项研究，专利CN 200410021080公开了一种多功能生防菌剂及其制备方法，通过添加多种矿质元素作为增效剂提高防治效果，专利CN200710057189公开了一种利用表面活性剂提高绿色木霉生防活性的方法，通过将表面活性剂Tween-80与绿色木霉可湿性粉剂复合施用来提高绿色木霉的定殖能力。但以上方法的目的均为提高木霉本身的生防活性，目前通过添加另一种具有抗菌促生作用的物质使其与木霉协同发挥作用，从而提高木霉定殖能力，提高生防活性和作物产量的方法还未见报道。
[0005]大量研究表明，壳聚糖能够强烈抑制有害真菌菌丝如霜霉菌，孢囊菌等，对西瓜枯萎病、水稻稻瘟病、番茄青枯病等植物病害具有良好的防治作用，并且壳聚糖还具有改良土壤的作用，可使土壤中有益菌如放线菌含量增加1000倍以上，增强土壤供肥能力，促进土壤中有益微生物的生长，使有益菌在土壤中的定殖能力增强。因此壳聚糖可作为木霉孢子制剂的添加剂与木霉协同发挥作用，但目前壳聚糖主要用于生产被誉为“人体第六大生命要素”的壳寡糖，直接将优质壳聚糖添加到木霉孢子制剂中需要一定成本。
[0006]在壳寡糖的生产过程中，由于壳聚糖不能完全水解，壳寡糖的得率约80-90%，仍有约10-20%的壳聚糖留在酶解残渣中。随壳寡糖产量的提高，残渣的量也逐步增大，对后期固废处理带来压力。
【发明内容】
[0007]本发明针对上述不足，提供一种木霉孢子制剂及其制备方法。本发明将壳聚糖的促生、抗菌作用与木霉的抗菌作用相结合，生产出的木霉孢子制剂具有更高的生防活性和更广阔的应用范围，同时可明显促进植物生长、提高作物产量。由于使用壳聚糖作为添加剂，还可改良土壤，提高土壤供肥能力，促进土壤中有益微生物的生长，使木霉在土壤中的定殖能力增强，从而提高木霉生防活性。本发明采用壳寡糖生产过程中产生的酶解渣为原料，真正做到变废为宝，降低生产成本的同时解决了壳聚糖酶解渣的处理问题。本发明工艺合理，成本低廉，易于实施，产品毒性低，无残留，具有良好的经济效益、环境效益和社会效益。
[0008]本发明所述的木霉孢子制剂，其有效成分主要为壳聚糖酶解渣和木霉孢子。
[0009]所述木霉可以是绿色木霉(Trichoderma viride )，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，康氏木霉(Trichoderma koningii)，绿粘帚霉(Trichoderma virens)等对多种植物病害具有防治作用的生防木霉菌。
[0010]所述壳聚糖酶解渣主要成分为脱乙酰度60%以上的壳聚糖，壳聚糖含量在90%以上。
[0011]所述的木霉孢子制剂的剂型为颗粒剂或可湿性粉剂。以重量百分比计，其原料配比为:壳聚糖酶解渣0.25-2.5%,含木霉孢子的固体发酵物4.5-89.75%,助剂10-93 %。
[0012]本发明所述的木霉孢子制剂的具体制备步骤为:
[0013](I)木霉菌种活化:将4°C下保存在PDA培养基上的试管斜面木霉菌种转移至20-25°C条件下活化4-8h;
[0014](2)木霉液体种子制备:在无菌操作台上，用无菌水将经过活化的试管斜面木霉菌种制成菌体悬浮液，接种至液体种子培养基中，振荡培养，得木霉液体种子液；
[0015](3)木霉固体发酵:将种子液按接种量4-10%接种到固体培养基中，调节含水率为40-50 %，pH为4-6，在温度20-30 °C，湿度65-90 %下培养6_8d，自然风干或低于50 °C烘干，得含木霉孢子的固体发酵物；
[0016](4)壳聚糖酶解渣的处理:将壳寡糖生产过程中对壳聚糖酶解后产生的絮凝沉淀经固液分离后调节pH至4.5-6.5，自然风干或低于50°C烘干；
[0017](5)壳聚糖酶解渣和助剂添加到含木霉孢子的固体发酵物中制备木霉孢子制剂。
[0018]进一步的，其更加具体的步骤为:
[0019](I)木霉菌种活化:将4°C下保存在PDA培养基上的试管斜面木霉菌种转移至20-25°C条件下活化4-8h。
[0020](2)木霉液体种子制备:
[0021 ]液体种子培养基的组成，按重量计(w/w)为:蔗糖2-4%，酵母浸粉0.2-1 %，硫酸镁0.02-0.1%，磷酸二氢钾0.01-0.05%，加水至100mL。
[0022]培养基成分中，蔗糖可为木霉液体种子培养提供足量的速效碳源;酵母浸粉主要提供氮源，其中含有的氨基酸、维生素还可作为木霉的生长因子提高其产率和活性;磷酸二氢钾作为缓冲剂，同时提供磷元素;硫酸镁则作为无机盐有助于提高木霉对自身产生的抗生素的耐性;各成分的相对含量是对几种木霉的培养基进行优化实验后筛选得到的优选范围，可以保证木霉液体种子制备满足后续实验要求，过大或过小无法保证种子的菌量和活性。
[0023]将装有上述培养基的三角瓶在高压灭菌锅中121°C灭菌30min，取出，冷却至室温；
[0024]在无菌操作台上，用1mL无菌水将经过活化的试管斜面木霉菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有液体种子培养基的三角瓶中，接种量为I支试管菌种接种I个三角瓶。
[0025]液体种子培养条件:pH值自然，培养温度24-28°C，摇床转速75_200r/min，培养时间为 24-48h。
[0026](3)木霉固体发酵:
[0027]固体培养基组成为:豆柏0.5-1.5kg，棉籽壳4_8kg，玉米粉2_4kg，磷酸二氢钾
0.25-0.75g，硫酸镁 2.5-7.5g，尿素 15_25g，加水 8_12L ；
[0028]培养基成分中，棉籽壳和玉米粉主要提供缓效碳源，豆柏主要提供缓效氮源，促进木霉菌体生长并产生较多优质孢子，其中含有的氨基酸、维生素还可作为木霉的生长因子提高其产率和活性;磷酸二氢钾作为缓冲剂，同时提供磷元素;硫酸镁则作为无机盐有助于提高木霉对自身产生的抗生素的耐性;尿素的加入不仅为木霉发酵提供氮源，还具有调节代谢的作用，另外，没有利用完全的尿素还可作为木霉孢子制剂的有效成分，起到促生和改良土壤的作用;各成分的相对含量是对几种木霉的培养基进行优化实验后筛选得到的优选范围，可以保证木霉固体发酵得到足量的孢子。
[0029]将装有上述固体培养基的固体发酵罐121°C灭菌30min，冷却至室温；
[0030]将培养后的木霉液体种子液按接种量4-10%(v/w)接种到灭菌后的固体发酵罐中，调节含水率为40-50%，pH值为4-6，在温度20-30°C，湿度65-90%下培养6_8d，自然风干或低于50°C烘干，得含木霉孢子的固体发酵物。该步骤中，含水率可以用无菌水调节，pH值可以用稀醋酸调节，均属于常规操作。
[0031]发酵结束后测定含木霉孢子的固体发酵物的pH值及孢子数；
[0032]孢子数测定方法如下:取0.5g固体发酵物，用含0.1 % (v/v)吐温的无菌水稀释100倍，在磁力搅拌器上搅拌20min，用血球计数板在显微镜下统计孢子数。
[0033](4)壳聚糖酶解渣的处理:
[0034]将壳寡糖生产过程中对壳聚糖酶解后产生的絮凝沉淀经固液分离后采用稀醋酸调节PH值至4.5-6.5;由于前期壳聚糖酶解后有调节pH值至7-8的步骤，因此固液分离后得到的含水率较高的絮凝沉淀pH值偏碱，为了能够将酶解渣直接用于木霉制剂的制备，此处需要预先调节pH值至4.5-6.5；
[0035]将上述絮凝沉淀自然风干或低于50°C烘干;将壳聚糖酶解渣干燥有利于保存，并且有利于后期直接用于木霉制剂的制备；
[0036]经上述步骤处理后得到的固体主要成分为脱乙酰度60%以上的壳聚糖和少量残余的壳寡糖，壳聚糖含量在90%以上。
[0037](5)将壳聚糖酶解渣和常用助剂添加到含木霉孢子的固体发酵物中制备木霉孢子颗粒剂或可湿性粉剂:
[0038]A、木霉颗粒剂制备工艺为:
[0039]将处理后的壳聚糖酶解渣溶解于体积百分比为2%的醋酸中，配制成5-10% (w/v)的溶液，调节pH值为4.5-6.5;此步骤中，醋酸有两个作用，一是由于壳聚糖酶解渣在中性水中的溶解度较低，因此将稀醋酸作为壳聚糖酶解渣的溶剂;二是醋酸可作为该制剂的有效成分之一，加强制剂的抗菌效果;醋酸的加入量过低无法作为良好的溶剂，过高则酸性太强，对制剂效果造成负面影响。
[0040]将上述5-10% (w/v)的壳聚糖酶解渣溶液按颗粒剂预期制备总重量的5-10% (v/w)加入到含木霉孢子的固体发酵物，即壳聚糖酶解渣干重所占百分比为0.25-1 %，充分混合均匀，得固体发酵载体;其中含木霉孢子的固体发酵物用量按照“颗