一种固定化微生物颗粒及其制备方法及应用及包埋率检测方法

1.本发明属于农用微生物菌剂领域，具体涉及一种固定化微生物颗粒及其制备方法及应用及包埋率检测方法。


背景技术：

2.微生物菌剂在促进农作物生长、提高农作物产量、改善和还原农产品品质等方面有明显功效。但目前而言，普通的微生物菌剂仍然存在保质期短，微生物与土壤中的土著微生物竞争力弱等缺点。微生物固定化技术通过将功能菌株包埋固定在载体中，为其提供一层保护性外壳，水分和营养物质可通过载体上的孔隙渗入，而其产生的生物活性物质可释放至载体外，这种技术能提高微生物菌剂对ph、温度、光照等外界环境因素的耐受能力，当外界环境发生较大变化时，由于固定化微生物包埋于球体内部，包埋菌株仍够保持一定活性，对外界环境表现出一定的耐受性。这种方式解决了游离菌体易流失，对外界环境抵抗能力弱，在土壤中定殖困难的缺点。
3.尽管固定化微生物技术已被广泛研究，但其制备工艺均为先发酵，再包埋，常见的包埋技术为海藻酸钠与菌液混匀后滴加至含ca
2+
的溶液中，交联一段时间后形成包埋着菌株的海藻酸钙凝胶微球，再打捞出来。但这种技术存在制备步骤较长、装置复杂、对环境洁净度要求较高等缺点。
4.因此，现提出一种固定化微生物颗粒及其制备方法及应用及包埋率检测方法，该固定化微生物颗粒能在土壤中遇水后自动包埋，且该固定化微生物颗粒制备方法简单，解决了当前固定化微生物技术步骤繁琐、生产装置复杂等问题。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明提出了一种固定化微生物颗粒及其制备方法及应用及包埋率检测方法，该制备方法制得的颗粒遇水能交联形成凝胶状包埋载体，同时将菌粉包埋于凝胶中，且该颗粒的制备方法简单，解决了当前固定化微生物技术步骤繁琐、生产装置复杂等问题。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
7.本发明一方面，提供了一种固定化微生物颗粒，该固定化微生物颗粒包括功能菌菌粉，营养物质，辅料，以及包埋载体的构建材料；
8.所述包埋载体的构建材料包括海藻酸钠、钙盐、固体酸；
9.所述辅料包括填料；
10.所述营养物质包括碳源、氮源。
11.海藻酸钠是一种线性高分子，有三个链段通过糖苷键连接而成，分子每个结构单元中有两个仲羟基，这些仲羟基都具有醇羟基的反应性能；当有ca2+、sr2+等阳离子存在时，g单元上的na+与二价阳离子发生离子交换反应，g单元堆积形成交联网络结构，从而形
成水凝胶；因此，本方案中固定化微生物颗粒中的钙盐可在水中解离出ca2+与海藻酸钠结合形成海藻酸钠凝胶，进而固定化微生物颗粒在遇水后，包埋载体的构建材料能自动交联形成凝胶状包埋载体。
12.优选的，所述的固定化微生物颗粒中，以质量份计，功能菌菌粉为1～20份、海藻酸钠为5～30份、钙盐为5～20份、固体酸为0～40份、碳源为3～40份、氮源为2～20份、填料为10～40份。
13.海藻酸钠的种类既可以是高粘度海藻酸钠，也可以是低粘度或其他种类的海藻酸钠，与ca
2+
交联生成海藻酸钙即可。
14.在本发明一种实施方案中，所述的功能菌菌粉包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的一种或两种。
15.在本发明一种实施方案中，所述的钙盐为难溶性钙盐；
16.所述难溶性钙盐包括但不限于乳酸钙、葡萄糖酸钙、edta-ca、碳酸钙、柠檬酸钙中的一种。
17.本发明中，钙盐优选难溶性钙盐，固体酸采用无结晶水的固体酸，所述的碳源、氮源、填料等原料则均需要经过干燥脱水处理，以避免制备的颗粒产品在存放过程发生反应。
18.在本发明一种实施方案中，所述的固体酸包括但不限于氨基磺酸或柠檬酸。
19.在本发明一种实施方案中，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、糖蜜、甘露醇、淀粉中的一种或多种；
20.所述的氮源为蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、硫酸铵中的一种或多种。
21.在本发明一种实施方案中，所述的填料包括但不限于硅藻土、白炭黑、淀粉、腐殖酸中的一种或多种。
22.在本发明一种实施方案中，所述的固定化微生物颗粒还包括润湿剂；且以质量份计，润湿剂为1～3份。
23.所述的润湿剂包括但不限于无水快t、拉开粉中的一种或两种。
24.另一方面，本发明还提供了一种制备固定化微生物颗粒的方法，包括以下步骤：
25.步骤s1、混合原料
26.将功能菌菌粉、海藻酸钠、钙盐、固体酸、碳源、氮源、填料，按配方比例混合均匀；步骤s2、造粒
27.将步骤s1中混合均匀的原料放入造粒机造粒，制得固定化微生物颗粒。
28.进一步地优选地，步骤s2中的造粒机可以采用但不限于挤压造粒、对辊造粒。
29.再另一方面，本发明还提供了一种固定化微生物颗粒的应用，是将固定化微生物颗粒放入土壤中，遇水即可生成海藻酸钙凝胶将菌体包埋，形成微胶囊包埋颗粒。
30.再另一方面，本发明还提供了一种固定化微生物颗粒的包埋率检测方法，包括以下步骤：
31.a、配制0.2mol/l的柠檬酸钠溶液，分装成数瓶，每瓶100ml，每瓶装入10～20粒瓷珠，备用；
32.配制数瓶无菌水，每瓶100ml，备用；
33.准备数根50ml离心管，121℃灭菌20min，冷却后备用；
34.b、制备微胶囊包埋颗粒
35.向灭菌后的离心管中加入10g固定化微生物颗粒，加入40ml已灭菌的无菌水，室温静置1h，得到微胶囊包埋颗粒；
36.c、微胶囊包埋颗粒溶解
37.将微胶囊包埋颗粒3000rpm/min离心10min，除去上清液，得到的沉淀用无菌水反复清洗3次；
38.设置实验组、对照组，实验组：将无菌水反复清洗后的沉淀移至步骤a配制的100ml 0.2mol/l的柠檬酸钠溶液中，35℃，150rpm/min振荡2h；
39.对照组：将实验组的柠檬酸钠换成步骤a配置的无菌水，按实验组相同方式处理；
40.d、实验组：待微胶囊包埋颗粒在0.2mol/l柠檬酸钠溶液中完全溶解后，用0.2mol/l柠檬酸钠溶液梯度稀释；取3个连续的稀释度，分别涂布于对应的选择性培养基平板上，每个稀释度重复3次，35℃培养24h；
41.对照组：将实验组的柠檬酸钠换成无菌水，按实验组相同方式处理；
42.e、将经步骤d处理后的实验组、对照组分别培养24h后，同一稀释度的三个平板菌落数均符合20～300个标准时，以该稀释度的平板作为计数标准；
43.当三个稀释度中只有一个稀释度符合计数标准时，以该稀释度的平均菌落数计算活菌数；
44.当三个稀释度中有两个稀释度符合计数标准时，按两者菌落总数的比值确定，两者比值≤2时则计算两者平均菌落数为活菌数，两者比值＞2时则以稀释度小的平均菌落数计算活菌数；
45.当三个稀释度均符合计数标准时，以最小稀释度的平均菌落数计算活菌数；
46.包埋率m计算公式：
47.m＝(a-a)/a*100％
48.其中：a—用0.2mol/l柠檬酸钠处理的样品中的活菌数(个/ml)
49.a—用无菌水处理的样品中的活菌数(个/ml)；
50.其中，所述步骤c微胶囊包埋颗粒溶解还可以是：
51.将微胶囊包埋颗粒3000rpm/min离心10min，除去上清液，得到的沉淀用无菌水反复清洗3次；
52.实验组：将无菌水反复清洗后的沉淀移至100ml 0.2mol/l的柠檬酸钠溶液中静置至完全溶解；
53.对照组：将实验组的柠檬酸钠换成无菌水，按实验组相同方式处理。
54.需说明的是：步骤d中所述的选择性培养基，是能选择性区分目标菌株的培养基；利用选择性培养基，可以实现在培养基内仅微胶囊包埋颗粒内的目标菌株生长。
55.需说明的是：本发明中一种固定化微生物颗粒的应用，不局限于将固定化微生物颗粒放入土壤中，也可以是放入可代替土壤的其他环境中。
56.需说明的是：本发明的核心创造点在于固定化微生物颗粒中含有制备好的功能菌菌粉和包埋载体的构建材料，且包埋载体的构建材料包括了海藻酸钠、钙盐、酸，从而在该颗粒遇水时，钙盐解离出ca
2+
与海藻酸钠结合形成海藻酸钠凝胶，且在形成凝胶过程中，将功能菌菌粉包埋，实现菌剂颗粒在土壤中遇水自动包埋。
57.需说明的是：海藻酸钙较稳定不溶于水，可溶于强酸，但强酸会杀死微生物，故选择柠檬酸钠溶解海藻酸钙，柠檬酸钠具有极好的溶解性能，是一种弱酸强碱盐，与柠檬酸配伍可组成较强的ph缓冲剂，本发明中，包埋率检测方法选择的柠檬酸钠浓度可完全溶解海藻酸钙，又不大幅改变溶液的ph值，减少对微生物的伤害的同时保证海藻酸钙完全溶解并释放出微生物。
58.本发明的有益效果是：(1)本发明利用钙盐在水中解离出ca
2+
与海藻酸钠结合形成海藻酸钠凝胶的原理，以制备好的功能菌菌粉为主要成分，以海藻酸钠、钙盐、酸、作为包埋载体的构建材料，添加营养物质和填料并造粒，使得制成的颗粒遇水能交联形成凝胶状包埋载体，同时将菌粉包埋于凝胶中，实现菌剂颗粒在土壤中遇水自动包埋的效果，从而本发明提供了一种新的固定化技术，以及一种新的包埋方式；
59.(2)与现有的技术相比，本发明生产工艺简单、对生产环境洁净度无要求(不需要提供无菌环境)，极大的节约了时间和经济成本，生产的固定化颗粒施用至土壤中后才会将菌株包埋，并发挥作用，避免了生产时包埋好的颗粒一段时间后降解的问题，此外，本发明还提供了对应固定化技术的菌株包埋率测定方法。
附图说明
60.图1为本发明实施例1得到的微胶囊包埋颗粒的sem表征结果
具体实施方式
61.下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
62.实施例1
63.一种固定化微生物颗粒及其制备方法：
64.将枯草芽孢杆菌菌粉50g、低粘度海藻酸钠100g、乳酸钙200g、柠檬酸150g、甘露醇150g、葡萄糖100g、蛋白胨40g、硅藻土200g、无水快t10g按比例混合均匀，添加20ml水，混合均匀后使用挤压造粒，然后35-45℃烘干，得到固定化微生物颗粒。
65.实施例2
66.一种固定化微生物颗粒及其制备方法：
67.将地衣芽孢杆菌菌粉50g，低粘度海藻酸钠300g，乳酸钙150g，氨基磺酸70g，葡萄糖50g，硅藻土240g，淀粉100g，蛋白胨30g，无水快t10g，混合均匀后进行干法造粒，得到固定化微生物颗粒。
68.实施例3
69.一种固定化微生物颗粒及其制备方法：
70.将解淀粉芽孢杆菌菌粉40g，低粘度海藻酸钠250g，碳酸钙130g，柠檬酸390g，葡萄糖50g，硅藻土80g，白炭黑40g，蛋白胨20g，使用干法造粒，得到固定化微生物颗粒。
71.实施例4
72.将实施例1、实施例2、实施例3制备得到的固定化微生物颗粒按照50kg/亩的量分别均匀播撒在土中，随后将其旋耕于地表下5-10cm，下雨时固定化微生物颗粒遇水生成海藻酸钙凝胶将菌体包埋，形成微胶囊包埋颗粒；对照组是对应将实施例1、实施例2、实施例3
配方中的物料混匀，不做挤压，播撒方式同前。雨后2天向土壤中栽种长势一致的小白菜幼苗，30天后，测定小白菜的根长、株高、鲜重、干重，含水量(结果见表1)。
73.表1不同处理小白菜根长、株高、鲜重、干重及含水量
74.分组根长(cm)株高(cm)鲜重(g)干重(g)含水量(％)实施例19.21
±
0.5015.96
±
1.2159.82
±
2.542.91
±
0.1295.13对照组16.98
±
0.3812.67
±
0.9844.13
±
1.731.76
±
0.0796.01实施例28.97
±
0.5715.75
±
1.1460.44
±
2.122.55
±
0.0995.78对照组26.45
±
0.4213.02
±
0.8745.84
±
1.561.92
±
0.0795.81实施例39.26
±
0.5215.81
±
1.2957.76
±
3.152.59
±
0.0495.52对照组36.13
±
0.3412.41
±
0.7942.87
±
1.921.60
±
0.0796.26
75.备注：表中实施例1、实施例2、实施例3指播撒的微生物固定化颗粒，对照组1、对照组2、对照组3指播撒的实施例1、实施例2、实施例3相同配方的干粉(未进行造粒)。
76.结论：由表1可知，对于根长，实施例1、实施例2、实施例3中的配方相比对照组分别提高了31.9％、39.1％、51.1％；对于株高，实施例1、实施例2、实施例3相比对照组分别提高了26.0％、21.0％、27.4％；对于鲜重，实施例1、实施例2、实施例3相比对照组分别提高了35.6％、31.8％、34.7％；对于干重，实施例1、实施例2、实施例3相比对照组分别提高了65.3％、32.8％、61.8％。上述结果表明，相比普通的微生物菌粉(同配方未进行造粒)，使用固定化微生物颗粒提高了小白菜的根长、株高、鲜重和干重，说明施用固定化微生物颗粒对小白菜具有更强的促长功能。
77.实施例5
78.本实施例是以实施例1制备得到的固定化微生物颗粒为实验样品，进行包埋率的检测。
79.检测步骤：
80.a、配制0.2mol/l的柠檬酸钠溶液，分装成数瓶，每瓶100ml，每瓶装入20粒瓷珠，备用；
81.配制数瓶无菌水，每瓶100ml；
82.准备数根50ml离心管，121℃灭菌20min，冷却后备用；
83.b、制备微胶囊包埋颗粒
84.向灭菌后的离心管中加入10g实施例1所制备的固定化微生物颗粒，并加入40ml已灭菌的无菌水，室温静置1h，得到微胶囊包埋颗粒；
85.c、微胶囊包埋颗粒溶解
86.将微胶囊包埋颗粒3000rpm/min离心10min，除去上清液，得到的沉淀用无菌水反复清洗3次；
87.实验组：将无菌水反复清洗后的沉淀移至100ml 0.2mol/l的柠檬酸钠溶液中，35℃，150rpm/min振荡2h；
88.对照组：将实验组的柠檬酸钠换成无菌水，按相实验组相同方式处理；
89.d、实验组：待微胶囊包埋颗粒在0.2mol/l柠檬酸钠溶液中完全溶解后，取5ml溶解后的液体，加入到45ml0.2 mol/l柠檬酸钠溶液中，进行梯度稀释；取3个连续的稀释度，分别涂布于对应的选择性培养基上，每个稀释度重复3次，35℃培养24h；
90.对照组：将实验组的柠檬酸钠换成无菌水，按相同方式处理；
91.e、将经步骤d处理后的实验组、对照组分别培养24h后，实验组中或对照组中，同一稀释度的三个平板菌落数均在20～300个时，该稀释度的三个平板即可作为计数标准；
92.当三个稀释度中只有一个稀释度符合计数标准时，以该稀释度的平均菌落数计算活菌数；
93.当三个稀释度中有两个稀释度符合计数标准时，按两者菌落总数的比值确定，两者比值≤2时则计算两者平均菌落数为活菌数，两者比值＞2时则以稀释度小的平均菌落数计算活菌数；
94.当三个稀释度均符合计数标准时，以最小稀释度的平均菌落数计算活菌数；
95.包埋率m计算公式：
96.m＝(a-a)/a*100％
97.其中：a—用0.2mol/l柠檬酸钠处理的样品中的活菌数(个/g)
98.a—用无菌水处理的样品中的活菌数(个/g)。
99.本实施例中，实验组为0.2mol/l柠檬酸钠处理的微胶囊包埋颗粒，对照组为无菌水处理的微胶囊包埋颗粒，因此，经计算，a为10x109个/g；a为1x109个/g；
100.因此，m＝(a-a)/a*100％＝90％
101.结论：本实施例中制备的固定化微生物颗粒，其遇水之后形成的微胶囊包埋颗粒对枯草芽孢杆菌的包埋率达到了90％，表明本实施方案能够实现对枯草芽孢杆菌的有效包埋和固定，菌株可在微囊中大量增殖，随着包埋材料的降解，大量有活力的菌株可释放并在土壤中形成一定的优势种群，发挥其功能，解决了传统菌粉施入环境后流失，不能定殖等问题。
102.实施例6
103.本实施例是以实施例1制备得到的固定化微生物颗粒为实验样品，利用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，sem)对微胶囊固定化颗粒进行了表征。
104.实验步骤
105.步骤a、制备微胶囊包埋颗粒
106.向灭菌后的离心管中加入10g实施例1所制备的固定化微生物颗粒，并加入40ml已灭菌的无菌水，得到微胶囊固定化颗粒，并室温培养10h，使芽孢萌发；
107.步骤b、sem样品制备
108.将步骤a中得到的微胶囊固定化颗粒3000rpm/min离心10min，弃去上清，加入2.5％戊二醛淹没样品，4℃固定过夜；用0.1m，ph7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1％的锇酸溶液固定样品1-2h；小心取出锇酸废液，用0.1m，ph7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度(包括30％，50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理两次，每次20min；用乙醇与醋酸异戊酯的混合液(v/v＝1/1)处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1h；临界点干燥后，镀膜，最后将处理好的样品在扫描电镜中观察。
109.实施例1得到的微胶囊固定化颗粒的sem表征结果见图1，图中a为被固定化的菌体，b为未被固定化的菌体，表明实施例1所设计的方案能够实现对枯草芽孢杆菌的包埋固定。
110.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。