细菌外膜囊泡提取方法

本发明涉及一种外膜囊泡提取方法。

背景技术：

1、细胞外膜囊泡(omv)是一种由细胞释放的天然纳米级囊泡，它可通过膜融合、受体-配体相互作用、细胞内吞或吞噬等多种机制，将携带的生物活性分子从供体细胞转移到受体细胞。evs具有生物相容性、生物可降解性、低毒性和非免疫原性等优点，是纳米医学中最有前景的候选者之一。

2、细胞外膜囊泡(omv)是细胞主动释放的纳米级膜囊泡。基于其生物发生、大小和生物物理性质，可以进一步分类(例如外泌体、微泡)。尽管最初被认为是细胞碎片，并且因此被低估，但evs现在越来越被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体。尽管极具临床应用潜力，但由于目前缺乏对evs的灵敏制备和分析技术，所以在临床转化上仍有障碍。

技术实现思路

1、本发明提供了一种细菌外膜囊泡提取方法，本发明可以高效、大量制备的高纯度外膜囊泡。

2、本发明细菌外膜囊泡提取方法按以下步骤进行：

3、一、将菌液离心弃去上清，然后加入ty液体培养基中，30℃孵育6h；

4、二、外膜囊泡的收集：将经过6h孵育的悬浊液，3000g转速离心10min，弃去菌体，收集上清液；

5、三、差速离心：

6、3.1、300g，4℃，离心10min，弃沉淀；

7、3.2、2000g，4℃，离心10min，弃沉淀；

8、3.3、10,000g，4℃，离心30min，弃沉淀，收集上清液，用孔径0.45μm过滤器过滤；

9、3.4、滤液110000g，4℃，离心70min，弃上清液；

10、3.5、沉淀用pbs重悬沉淀，用孔径0.22μm膜过滤器过滤，滤液110000g，4℃，离心70min，弃上清液，得到初步细菌外膜囊泡；

11、四、将步骤三得到的初步细菌外膜囊泡加入pbs，然后加入碘克沙醇制成体积为3ml的含外膜囊泡的40％碘克沙醇悬液；

12、五、用灭菌水和碘克沙醇溶液，配置浓度为5％、10％、20％的碘克沙醇溶液；然后将将步骤四制备的3ml的含外膜囊泡的40％碘克沙醇悬液加入到超速离心管中，然后依次加入3ml浓度为20％的碘克沙醇溶液、3ml浓度为10％的碘克沙醇溶液和3ml浓度为5％的碘克沙醇溶液，之后100000g离心18h；

13、六、步骤五超速离心后将超速离心管中的悬液分12层，每层1ml，从上至下依次吸取1ml并保证移液器枪头每次不插入下一层；收集第4～6管，即得到细菌外膜囊泡。

14、本发明方法简单，能够获取73.5nm～115nm的细菌外膜囊泡，具有细菌外膜囊泡纯度高，外膜囊泡粒径分布集、外膜囊泡数量大等优点。

1.细菌外膜囊泡提取方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

2.根据权利要求1所述的细菌外膜囊泡提取方法，其特征在于步骤四：将步骤三得到的初步细菌外膜囊泡加入到800μl的pbs中至体积为1ml，然后加入2ml浓度为60％的碘克沙醇制成体积为3ml含外膜囊泡、碘克沙醇浓度为40％的悬液。

3.根据权利要求1所述的细菌外膜囊泡提取方法，其特征在于步骤三获得的初步细菌外膜囊泡用200μl的8m尿素重悬沉淀后-80℃保存。