一种干血斑核酸自动化提取组合物、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种干血斑核酸自动化提取组合物、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.干血斑样本的运输储存具有简便且低成本的优势，而且由于制备滤纸干血斑仅需要少量的血液样本，非常适合于作为新生儿遗传病筛查的标本类型。目前，干血斑样本核酸分离提取方法主要包括旋转离心柱提取法及及纳米磁珠提取法等。离心柱法提取核酸应用得很普及，该方法采用特殊的硅基质吸附材料，特点是：高盐酸性缓冲液存在时可特异性吸附dna，除去rna与蛋白质等不能结合的杂质，而低盐碱性缓冲液可洗脱结合在吸附柱上的dna，然而这种方法的缺点是样本需求量大，耗费样品较多，离心柱法提取核酸需要反复离心(使用离心机)同时还需要使用其他加热设备，整个核酸提取时间超过60分钟以上，同时需要耗费大量人力手动提取完成，无法应对未来大规模诊断筛查。纳米磁珠法核酸提取技术从2010年开始伴随基因测序技术开始得到快速发展，该方法特点在于经过表面特殊处理的纳米磁性微球(二氧化硅包裹三氧化二铁或四氧化三铁并且在二氧化硅表面包裹羟基或羧基基团)可以偶联核酸，核酸提取过程中可摆脱或减少反复离心的步骤，大大缩短提取时间。原理是先使用含有高盐化学细胞裂解液将样本进行裂解使细胞核内核酸得到释放，然后再将纳米磁性微球释放到高盐裂解液中与核酸相结合，再利用磁铁将微球转移至低盐清洗液中除盐除蛋白，最后转移至低盐溶液中洗脱，将微球表面结合的核酸洗脱下来最终得到纯净高浓度核酸。目前市面上有基于磁珠法提取干血斑核酸的试剂盒产品，但都还是需要使用人工操作完成提取，无法实现机器自动化提取。原因在于要想获得高纯度、高浓度的核酸还是需要借助离心机将干血斑中的大量蛋白杂质离心至底部，若不使用离心机会导致磁珠表面结合的核酸会与干血斑中大量蛋白、盐类及其他杂质缠绕在一起，无法清洗干净，提取的核酸不仅浓度极低同时对后续聚合酶链式反应实验结果有严重抑制干扰。目前市面上提取干血斑样本试剂盒细胞化学裂解液及清洗液中缺乏能够将蛋白及其他杂质有效快速沉淀的化学组分所以没有能实现匹配自动化核酸提取仪器使用的试剂盒产品。
3.因此，一种干血斑核酸自动化提取组合物、试剂盒及其应用亟待提出。


技术实现要素：

4.为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种干血斑核酸自动化提取组合物、试剂盒及其应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
6.本发明第一目的为提供一种干血斑核酸提取组合物，所述组合物包括：
7.裂解液1：异硫氰酸胍、tris-hcl h6.0、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇8000、曲拉通x100、超纯水；
8.裂解液2：盐酸胍、tris-hcl ph7.0、np-40、氯化锂、糖原、醋酸钠、超纯水；
9.其中，所述裂解液1中异硫氰酸胍浓度范围为1-10mol/l；tris-hclp h6.0浓度范围为1-100mmol/l；十二烷基硫酸钠的w/v比为0.1％-40％；聚乙二醇8000的w/v比为0.1％-20％；曲拉通x100的w/v比为0.1％-35％；超纯水的w/v比为1％-100％；
10.所述裂解液2中盐酸胍浓度范围为1-10mol/l；tris-hcl ph7.0浓度范围为1-100mmol/l；np-40的w/v比为0.1％-40；氯化锂浓度范围为1-400mmol/l；糖原20mg/ml的w/v比为0.1％-20％；醋酸钠浓度范围为1-100mmol/l；超纯水的w/v比为1％-100％。
11.优选的，所述组合物还包括清洗液1、清洗液2和洗脱液。
12.优选的，所述清洗液1包括以下组分：异硫氰酸胍、tris-hcl ph7.0、曲拉通x100、异丙醇、超纯水；
13.所述清洗液2包括以下组分：tris-hcl ph8.0、无水乙醇、纳米磁珠原液、超纯水；
14.其中，所述清洗液1中异硫氰酸胍浓度范围为1-10mol/l；tris-hcl ph7.0浓度范围为1-100mmol/l；曲拉通x100的w/v比为0.1％-40％；异丙醇的w/v比为1％-100％；超纯水的w/v比为1％-100％；
15.所述清洗液2中tris-hcl ph8.0浓度范围为1-100mmol/l；无水乙醇的w/v比为1％-100％；浓度100mg/ml的纳米磁珠原液的w/v比为1％-100％；超纯水的w/v比为1％-100％。
16.优选的，所述洗脱液包括：tris-hcl ph8.0、edta、超纯水；
17.其中，所述洗脱液中tris-hcl ph8.0浓度范围为1-100mmol/l；原液浓度0.5m的edta浓度范围为1-100mmol/l；超纯水的w/v比为1％-100％。
18.本发明第二目的为提供一种干血斑核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括干血斑核酸提取组合物、试剂板和磁棒套，所述试剂板上设有若干v底深孔。
19.本发明第三目的为提供一种干血斑核酸提取组合物在核酸提取或核酸检测中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
20.优选的，所述干血斑来自新生儿血液样本。
21.优选的，所述干血斑来自新生儿外周血样本。
22.本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：
23.本发明所提供的干血斑核酸提取组合物中糖原、氯化锂及醋酸钠三种核酸沉淀剂的联用明显提升核酸沉淀效率，进而大幅度提高核酸提取量(对比不添加沉淀剂配方可提升单样本核酸提取总量超过40％)，同时，在两种裂解液中添加4种不同表面活性剂也可以提升核酸提取效率(对比添加其他不同表面活性剂配方可提升单样本核酸提取总量超过30％)，进而综合提升单样本核酸提取总量超过70％以上。
具体实施方式
24.以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
25.本实施例提供一种干血斑核酸提取组合物，所述组合物包括：裂解液1：异硫氰酸胍、tris-hcl h6.0、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇8000、曲拉通x100、超纯水；所述裂解液1中异硫氰酸胍浓度范围为1-10mol/l(最优选4.2mol/l)(蛋白变性剂)；tris-hclp h6.0浓度范围为1-100mmol/l(最优选68mmol/l)(ph调节剂)；十二烷基硫酸钠的w/v比为0.1％-40％
(最优选添加量5.3％)(蛋白变性剂)；聚乙二醇8000的w/v比为0.1％-20％(最优选添加量2.8％)(表面活性剂蛋白沉淀作用)；曲拉通x100的w/v比为0.1％-35％(最优选添加量7.7％)(表面活性剂蛋白溶解作用)；超纯水的w/v比为1％-100％(最优选添加量63.83％)；
26.裂解液2：盐酸胍、tris-hcl ph7.0、np-40、氯化锂、糖原、醋酸钠、超纯水；所述裂解液2中盐酸胍浓度范围为1-10mol/l(最优选3.4mol/l)(蛋白变性剂)；tris-hcl ph7.0浓度范围为1-100mmol/l(最优选29mmol/l)(ph调节剂)；np-40的w/v比为0.1％-40(最优选添加量1.4％)(蛋白溶解作用)；氯化锂浓度范围为1-400mmol/l(最优选110mmol/l)(核酸沉淀剂)；糖原20mg/ml的w/v比为0.1％-20％(最优选添加量1.35％)(核酸沉淀剂)；醋酸钠浓度范围为1-100mmol/l(最优选60mmol/l)(核酸沉淀剂)；超纯水的w/v比为1％-100％(最优选添加量76.45％)；
27.清洗液1：异硫氰酸胍、tris-hcl ph7.0、曲拉通x100、异丙醇、超纯水；所述清洗液1中异硫氰酸胍浓度范围为1-10mol/l(最优选2.6mol/l)(蛋白变性剂)；tris-hcl ph7.0浓度范围为1-100mmol/l(最优选40mmol/l)(ph调节剂)；曲拉通x100的w/v比为0.1％-40％(最优选添加量1.5％)(蛋白溶解作用)；异丙醇的w/v比为1％-100％(最优选添加量42.6％)(蛋白溶解作用)；超纯水的w/v比为1％-100％(最优选添加量33.78％)；
28.清洗液2：tris-hcl ph8.0、无水乙醇、纳米磁珠原液、超纯水；所述清洗液2中tris-hcl ph8.0浓度范围为1-100mmol/l(最优选20mmol/l)(ph调节剂)；无水乙醇的w/v比为1％-100％(最优选添加量75％)(核酸沉淀及除盐作用)；浓度100mg/ml的纳米磁珠原液的w/v比为1％-100％(最优选添加量4.3％)(核酸结合作用)；超纯水的w/v比为1％-100％(最优选添加量22.74％)；
29.洗脱液：tris-hcl ph8.0、edta、超纯水；所述洗脱液中tris-hcl ph8.0浓度范围为1-100mmol/l(最优选10mmol/l)(ph调节剂)；原液浓度0.5m的edta浓度范围为1-100mmol/l(最优选5.5mmol/l)(核酸稳定剂)；超纯水的w/v比为1％-100％(最优选添加量96.7％)。
30.本实施例还提供一种干血斑核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括干血斑核酸提取组合物、试剂板和磁棒套，所述试剂板上设有若干v底深孔。本实施例所提供的干血斑核酸提取试剂盒，可以在全自动核酸提取仪上进行血斑样本核酸提取，彻底摆脱使用离心机。
31.本实施例还还提供一种干血斑核酸提取组合物在核酸提取或核酸检测中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
32.实施例1、利用干血斑核酸提取试剂盒提取干血斑基因组的dna
33.(1)准备工作
34.准备待测新生儿血液样本或新生儿外周血样本。
35.干血斑核酸提取试剂盒的包装规格为：64人份/盒，16人份/板。该试剂盒包括两部分：全自动提取耗材(pp材质2.2ml体积96方孔v底深孔板4块，8根8联磁棒套)以及提取组合物(单块板里包括裂解液1、裂解液2、清洗液1、清洗液2、洗脱液，共5组成分)。
36.(2)核酸提取操作过程
37.将待测样本加入提前准备好的预分装有提取组合物的试剂板中，然后将试剂板放入全自动核酸提取仪器上进行自动核酸提取，最终得到高浓度纯净的核酸，对后续实验无任何影响干扰。
38.实施例2、沉淀剂选择添加干血斑dna提取效率评价测试
39.(1)测试目的：评价选择不同沉淀剂及联用对干血斑样本dna提取得率影响；
40.(2)测试方法：采用裂解液2配方体系添加同等终浓度(100mm)的不同种类沉淀剂及相互联用方案进行干血斑样本核酸提取，随后采用美国life technology公司生产qubit3.0核酸定量仪进行核酸定量。测出的所有样本核酸提取总量数值采用统计学方法进行评价。
41.(3)测试样本类型及数量：干血斑样本每组8个
42.测试结果如下：
43.[0044][0045]
测试结果显示氯化锂-醋酸钠-糖原三种沉淀剂联用可显著提升干血斑样本核酸总量，对比其他测试组结果均值提取效率百分比超出至少40％以上。
[0046]
实施例3、请提供4种不同表面活性剂的添加干血斑dna提取效率评价测试
[0047]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围为之内。