基于补体因子的亲和层析的制作方法

本文报道了使用包含固定化的人c1q作为亲和配体的亲和层析柱及其用途。

背景技术：

1、免疫球蛋白通常包含两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。每个重链和轻链多肽含有可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基末端部分)，其包含能够与抗原相互作用的结合区。每个重链和轻链多肽包含恒定区(通常是羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体i)与携带fcγ受体(fcγr)的细胞(例如吞噬细胞)或ii)携带新生fc受体(fcrn)(也称为brambell受体)的细胞的结合。它还介导与某些因子的结合，包括经典补体系统的因子，如组分(c1q)。

2、人的先天免疫包括补体途径。该途径通过c1q(c1补体因子的识别亚基)与免疫靶标的结合而被激活。完整的c1q分子是包含三个单体结构单元(其表示为c1qa，c1qb和c1qc)中的每一个的六个拷贝的异聚体分子。每个单体单元包含n末端区域(3至9个残基)，胶原样结构域(跨越约81个残基)和球状结构域(球状头；跨越约135个残基)(sellar，gc，等人，biochem.j.274(1991)481-490)。c1q具有识别单元的功能，并且可以结合igg1的ch2结构域以及igm的ch3或ch4结构域(ghebrehiwet，b.等人，j.exp.med.160(1984)1375-1389)。

3、在wo2010/048313中，报道了用于纯化含fc融合蛋白的重组fcrn及其变体。magistrelli，g.等人报道了在哺乳动物细胞中稳健的重组fcrn产生，使得能够进行定向固定用于igg结合研究(j.immunol.meth.371(2012)20-29)。在wo2013/120929中报道了新生fc受体(fcrn)和β-2-微球蛋白(b2m)的固定化非共价复合体通常作为亲和层析配体的用途，并且例如通过测定抗体和参照抗体的保留时间的比率用于测定抗体的体内半寿期。

4、使用具有固定化人igg的亲和层析法纯化人c1q(参见例如assimeh，s.n等人，j.immunol.113(1974)225-234；kolb，w.p等人，j.immunol.122(1979)2103-2111)。

5、bally，i.，等人报道了全长人c1q的产生，其涉及hek 293-f哺乳动物细胞的稳定转染和亲和标签与c链的c末端的融合(proc.natl.acad.sci.usa 110(2013)8650-8655)。据报道，从生物化学和结构分析判断，所得重组(r)c1q分子与血清c1q相似，并且应显示出一束花的特征形状。通过表面等离振子共振分析其相互作用性质表明rc1q保留了血清c1q与c1s-c1r-c1r-c1s四聚体结合的能力，以识别生理c1q配体如igg。亲和标签用于纯化重组c1q。

6、svehag，s.-e和b，d报道了通过亲和层析和用二氨基烷基化合物解吸附来分离c1q结合免疫复合体(acta path.microbiol.scand.sect.c 84(1976)45-52)。gibbons，j.j.jr等人报道了固相c1q与聚集的人免疫球蛋白g的温度敏感性结合(biochim.biophys.acta670(1981)146-149)。uwatoko，s和mannik，m报道了通过c1q亲和层析和凝胶过滤从五种sle血浆中分离单体c1q结合igg(j.clin.invest.82(1982)816-824)。ghebrehiwet，b.等人报道了c1q与琼脂糖的偶联以及这种材料用于纯化c1qr的用途(j.exp.med.160(1984)1375-1389)。nethery，a.等人(j.immunol.meth.126(1990)57-60)报道了c1q-sepharose上免疫球蛋白m的一步纯化。uwatoko，s和mannik，m(j.clin.invest.82(1982)816-824)报道了通过c1q亲和层析和凝胶过滤从五种sle血浆中分离单体c1q结合igg。

7、moreau，c.等人(front.immunol.7(2016)article 79)报道了单链重组形式的人c1q球状区(c1q-scgr)的产生，其包含c1-a的n-至c-末端方向残基88-223，gly-ser-gly接头，c1qc的残基87至217，gly-ser-ala接头和c1qb的残基90至226(第2页和图1)。选择用来产生c1q-scgr的5'-3'a-c-b顺序也对应于染色体1p上的三个c1q基因的顺序。

8、pfueller，b.等人(arth.rheum.44(2001)1962-1963)公开了使用c1q柱用从猪血浆中分离的c1q通过免疫吸附成功治疗系统性红斑狼疮患者的先导研究的结果。

9、us 2015/329606公开了一种用于重组产生c1q蛋白或c1q蛋白变体的方法，其中从表达c1qa亚基或c1qa亚基变体，c1qb亚基或c1qb亚基的变体，c1qc亚基或c1qc亚基的变体的细胞的体外培养物中回收蛋白质，其中至少一个亚基或亚基变体在n-末端或c-末端也具有至少6个残基的氨基酸序列，其中至少40％是谷氨酸和/或天冬氨酸残基。

10、moreau，c.等人公开了补体蛋白c1q的识别结构域的单链形式的结构和功能表征(front.immunol.7(2016))。

11、yadav，s.等人公开了马来丝虫免疫调节蛋白肌钙网蛋白和人clq之间的蛋白质-蛋白质相互作用的计算机和体外研究(plos one 9(2014)e106413)。

12、us 2005/208586公开了衍生自c1q(第一补体成分分子c1的亚基)的多肽或非多肽。

技术实现思路

1、本文报道的一个方面是包含补体c1q亚组分亚基a至c的片段的融合多肽作为亲和层析配体的用途。

2、已经发现，利用本文报道的融合多肽，现在可以分离、分隔和表征关于其密切相关的抗体种类(即在单个或有限数量的氨基酸残基上不同，或在糖基化模式上不同)的体内特性，其影响分析物和融合多肽之间的相互作用，即fc-区与c1q的相互作用。

3、因此，利用本文报道的方法，可以分离一种亲本抗体的不同变体并确定这些变体之间的特定比例，这利用目前已知的方法是不可能的，因为它们仅提供修饰的总和而不是个别种类(即，对于亲本和变体1和变体2以及变体1/2的混合物，质谱法提供包含变体1的分子的总数，即包含单个变异的变体(1)以及还包含第二变异的变体(1/2))。

4、已经发现，对于给定条件，野生型igg1抗体在本文提供的实施例中概述的条件下具有约25至28分钟的保留时间。

5、与具有亲本未修饰的fc-区的抗体相比，具有降低的c1q结合的具有经修饰的fc-区的抗体具有较短的保留时间，而具有增强的c1q结合的具有经修饰的fc-区的抗体具有更长的保留时间。

6、本文报道的一个方面是根据式i的融合多肽

7、tag-x1-c1qa-x2-c1qb-x3-c1qc-x4(式i)

8、其中，

9、x1表示第一肽接头，

10、x2表示第二肽接头，

11、x3表示第三肽接头，

12、x4表示第四肽接头，

13、x1，x2，x3，x4彼此独立地存在或不存在，

14、tag是氨基酸序列标签，

15、tag可以存在或不存在，

16、c1qa是seq id no：01的片段，

17、c1qb是seq id no：03的片段，

18、c1qc是seq id no：05的片段，和

19、-表示肽键。

20、在一个实施方案中，存在x1，x2和x3，并且不存在x4。

21、在一个实施方案中，存在x2，x3和x4，并且不存在x1。

22、在一个实施方案中，x1具有seq id no：10的氨基酸序列，x2具有seq id no：11或12的氨基酸序列，x3具有seq id no：13或14的氨基酸序列，并且x4不存在。

23、在一个实施方案中，x1不存在，x2具有seq id no：13或14的氨基酸序列，x3具有seq id no：11或12的氨基酸序列，并且x4具有seq id no：10的氨基酸序列。

24、在一个实施方案中，c1qa具有seq id no：07的氨基酸序列，c1qb具有seq id no：08的氨基酸序列，并且c1qc具有seq id no：09的氨基酸序列。

25、在一个实施方案中，tag存在并具有seq id no：15的氨基酸序列。

26、在一个实施方案中，x3存在并具有氨基酸序列ggggs(seq id no：23)。

27、在一个实施方案中，式i在n-或c-末端方向上从右到左表示融合多肽元件的序列(n-末端-clqc-c1qb-c1qa-c-末端)。

28、本文报道的一个方面是多聚体非共价复合体，其包含2至6个本文报道的融合多肽。

29、在一个实施方案中，在非共价复合体的至少一种融合多肽中存在tag，并且在非共价复合体的至少一种融合多肽中不存在tag。

30、本文报道的一个方面是如本文报道的融合多肽或如本文报道的多聚体复合体在亲和层析中作为亲和层析配体的用途。

31、在一个实施方案中，融合多肽或复合体固定在固相上。在一个实施方案中，融合多肽或多聚体复合体是生物素化的，并且固相用链霉抗生物素蛋白衍生化。

32、在一个实施方案中，亲和层析用于分离包含至少fc-区的抗体或融合多肽。在一个实施方案中，亲和层析是分析亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析是使用收集级分或不收集级分。

33、在一个实施方案中，固相是层析材料。在一个实施方案中，层析材料是琼脂糖(交联琼脂糖)。

34、在一个实施方案中，该用途是通过测定抗体和参照抗体的保留时间的比率来确定抗体的体内半寿期。

35、在一个实施方案中，该用途是用于从亲本抗体或亲本融合多肽的包含至少fc-区的c1q结合部分的经修饰抗体或修饰融合多肽的文库中筛选出与亲本抗体或亲本融合多肽相比，具有改变的c1q结合亲和力的那些经修饰抗体或修饰的融合多肽。

36、在一个实施方案中，该用途是用于鉴定抗体或融合多肽，其包含至少fc-区的c1q结合部分，该部分显示出与c1q的结合改变。

37、在一个实施方案中，抗体是融合多肽的单特异性抗体或抗体片段，或融合多肽的双特异性抗体或抗体片段，或融合多肽的三特异性抗体或抗体片段，或融合多肽的四特异性抗体或抗体片段。

38、在一个实施方案中，该用途是在具有盐梯度的亲和层析中。

39、在一个实施方案中，该用途是通过测定抗体和参照抗体的保留时间的比率来确定抗体的体内半寿期。

40、在一个实施方案中，该用途是用于分离包含至少fc-区的抗体或融合多肽。

41、在一个实施方案中，该用途是用于确定抗体的糖基化。

42、在一个实施方案中，该用途是用于鉴定抗体或融合多肽，所述抗体或融合多肽包含至少fc-区的c1q结合部分，所述部分显示出与c1q的结合改变。

43、本文报道的一个方面是用于选择具有预定体内半寿期的抗体的方法，其中进行层析并选择相对于野生型igg1在给定保留时间窗内具有保留时间的抗体。