一种玉米氮高效利用基因及其分子标记和应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种玉米氮高效利用基因及其分子标记和应用。


背景技术：

2.氮是植物生长发育所需的大量元素之一，它是植物体内除去碳、氢、氧三种元素之后含量最多的元素。氮素是蛋白质、核酸、磷脂、叶绿素、细胞分裂素等多种生物活性分子的重要组成部分，因此在细胞的形成、生长、植物细胞的各种代谢过程、光合作用、能量代谢以及细胞的分裂和伸长等方面具有重要的作用(crawford and forde,2002)。土壤氮的自然供应通常限制了大多数农业作物产量(xu et al.,2012)。过去几十年氮肥的使用增加了粮食的产量，减少世界饥饿。但是随着人口的增多，粮食产量也需要大幅度增加,这样以来氮肥的施用量也需要随之增加。从农业生产中释放的过量氮化合物威胁到空气，水和土壤的质量；释放到大气中的nox，加速了水的富营养化并使土壤酸化,造成环境污染(guo et al.,2010)。
3.玉米是重要的粮食作物、饲料来源和能源作物。目前我国玉米的总产量已经超过水稻、小麦成为第一大粮食作物。有研究表明：2050年，世界玉米产量需要翻一番才能满足不断增长的人口需求(ray et al.,2013)。而氮肥的使用可以显著的影响玉米产量。如何提高作物氮效率，降低氮肥流失带来的环境风险是当前中国农业生产面临的巨大挑战(zhang et al.,2013)。在不影响玉米产量增加的前提下，降低氮肥的投入，需要我们选育和推广氮高效的作物品种。而这在很大程度上取决于我们对玉米抗低氮胁迫应答分子机制的认识程度。


技术实现要素：

4.我们前期研究发现不同玉米自交系对氮素响应差异较大，即不同自交系组织中的no
3-浓度本身存在差异，同时不同自交系对低氮胁迫的响应也不同。我校国家玉米改良中心构建了由508份玉米自交系组成的关联群体(li et al.,2013)，通过将转录组测序分析获得的103万个基于基因的snp标记，与illumina公司已开发的包含56110个snp标记的maizesnp50beadchip芯片基因型数据相结合，获得了所有材料的高密度遗传连锁图谱(ganal et al.,2011；li et al.,2013)。我们以此为材料，以no
3-浓度为指标，利用全基因组关联分析(gwas)，挖掘与氮利用效率相关的因子。
5.一方面，本技术提供了一种玉米氮高效利用基因zmncrg1，其编码的氨基酸序列为seq id no.2。
6.进一步地，其核苷酸序列为seq id no.1。
7.另一方面，本技术提供了上述基因在耐低氮品种或氮高效利用植物品种育种中的应用。
8.进一步地，所述植物为玉米。
9.另一方面，本技术提供了一种玉米氮高效利用标志物zmncrg1-indel，其核苷酸序列为seq id no.3。
10.另一方面，本技术提供了检测玉米氮高效利用标志物的试剂盒，其包括检测上述标志物zmncrg1-indel的试剂。
11.进一步地，所述检测上述标志物zmncrg1-indel的试剂为序列为seq id no.6和seq id no.7的引物对。
12.另一方面，本技术提供了鉴定玉米耐低氮品种或氮高效利用品种的方法，包括
13.使用序列为seq id no.6和seq id no.7的引物对扩增待鉴定品种的基因组dna；
14.检测扩增产物是否包括上述zmncrg1-indel，如果不包括zmncrg1-indel，则待鉴定品种为耐低氮品种或氮高效利用品种，如果包括zmncrg1-indel，则待鉴定品种为非耐低氮品种或氮高效利用品种。
15.进一步地，检测扩增产物是否包括上述zmncrg1-indel通过测序进行。
16.另一方面，本技术提供了上述试剂盒或者方法在玉米耐低氮品种或氮高效利用品种育种中的应用。
17.本领域技术人员可以根据本领域已知的snp检测方法检测zmncrg1-indel并提供相应试剂和试剂盒，这些方法包括但不限于扩增后测序、taqman检测方法、熔解曲线法、arms-pcr法、snapshot法、kasp法、质谱法等。试剂盒中的其他试剂本领域公知。
18.本技术中的玉米氮高效利用基因zmncrg1以及相应蛋白不仅包括seq id no.1和seq id no.2的基因和蛋白，还包括在seq id no.1和seq id no.2基础上进行一个或者多个取代缺失添加形成的，具有相同或者类似功能的序列。
19.本技术中所述的育种方法包括各种自交和杂交的传统育种方法，以及分子生物学育种方法，如过表达zmncrg1。
20.有益效果：
21.本发明提供了一种新的玉米氮高效利用显著位点，及其相关的氮高效利用基因zmncrg1的核苷酸序列和其对应的蛋白质氨基酸序列，并且鉴定了一个位于在其启动子区域插入或缺失的，与玉米氮高效利用连锁的大片段，该片段的插入或缺失，可作为玉米氮高效利用的分子标记。本发明还提供了一种用于检测本发明的玉米氮高效分子标记的引物对和试剂盒，以及检测玉米是否氮高效利用型的方法。
22.由于玉米氮高效利用属数量性状遗传，表型分析耗时费力，上述的玉米氮高效利用主效位点、氮高效利用基因及其蛋白质、分子标记、引物对和试剂盒都可以应用于玉米耐低氮育种中，在玉米种子期间或子叶长出的早期阶段就可鉴定，省时而且准确，可以加速玉米耐低氮品种选育进程。
附图说明
23.图1为低氮胁迫下(0.05mm no
3-)玉米自交系组织中no
3-浓度的曼哈顿图；箭头指示no
3-浓度的主效位点(zmncrg1)。
24.图2为氮高效利用基因zmncrg1遗传验证；(a)为在正常氮或低氮处理条件下生长了3周的野生型和zmncrg1基因敲除植株(zmncrg1
crispr-1，zmncrg1
crispr-2)的生长情况；(b)为(a)对应植株体内硝酸根含量；其中(a)中的标尺大小为10cm。zmncrg1基因的遗传验证：
在正常4mm no
3-浓度下(normal n；nn)，zmncrg1
crispr-1和zmncrg1
crispr-2突变体的生长与野生型没有差异(a和d)，体内no
3-浓度也无差异(b和e)。但对0.05mm no
3-低氮胁迫(low n；ln)的响应，突变体较野生型敏感。与野生型相比，突变体的第一片叶已经枯黄(a和d)，其相应的no
3-浓度随着低氮胁迫也显著下降(c和f)。箭头指示枯黄的叶片。**代表差异显著(p《0.01)。
25.图3为低氮胁迫下(0.05mm no
3-)，zmncrg1遗传变异与硝酸根含量的关联分析和相应区间的ld分析。包含zmncrg1 2kb基因组区间，启动子最显著的indel(indel-194),编码区snp45为同义突变，snp92在编码氨基酸中产生pro到leu的变化。
26.图4为利用引物对i在dan340和cimbl144中进行pcr扩增的结果；其中，m为分子量marker。
27.图5为zmncrg1基因编码序列连接入t载体后的载体图谱。
28.图6为zmncrg1编码的蛋白定位在细胞膜；在玉米原生质体中观察zmncrg1-gfp亚细胞定位。
29.图7zmncrg1与亚硝酸还原酶存在相互作用。
具体实施方式
30.以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
31.除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
32.实施例1玉米氮高效主效位点鉴定及功能分析
33.我校国家玉米改良中心构建了由508份玉米自交系组成的关联群体(li et al.,2013)，通过将转录组测序分析获得的103万个基于基因的snp标记，与illumina公司已开发的包含56110个snp标记的maizesnp50 beadchip芯片基因型数据相结合，获得了所有材料的高密度遗传连锁图谱(ganal et al.,2011；li et al.,2013)。我们以此为材料，以no
3-浓度为指标，利用全基因组关联分析(gwas)，挖掘与氮利用效率相关的因子。本发明通过基于混合线性模型的分析在2号染色体上定位了一个主效位点，如图1所示，它位于2号染色体58mb的位置。在此候选区域鉴定到一个候选基因，命名为zmncrg1。
34.通过设计crspr-cas9敲除靶点构建载体pbuc411-zmncrg1,载体转入农杆菌eha105，然后进行玉米b73-329转化获得转基因植株，通过对包括靶点在内的基因片段进行pcr测序确定转基因阳性植株。获得了两个zmncrg1候选基因的敲除材料(命名为zmncrg1
crispr-1和zmncrg1
crispr-2)，并证明这两个突变体相对于野生型表现出低氮敏感的表型，如图2所示，表明zmncrg1基因敲除植株对低氮胁迫更敏感，表现为叶片黄化，说明该基因的确是候选基因。
35.基于maizegdb网站对zmncrg1基因结构的预测，基因全长(从起始密码子到终止密码子)468bp，包含一个外显子，其中编码区序列全长468bp。为了克隆zmncrg1全长编码序列，以生长10天的玉米自交系b73幼苗为材料，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物总rna提取试剂盒提取总rna，并通过使用聚合美(北京)生物技术有限公司的反转录酶进行反转录获得cdna，用zmncrg1特异的引物(正向引物zmncrg1-gene-f atggcaactttcgcctcac(seq id no.4)；反向引物zmncrg1-gene-r ctagtacaggtcggcctccctg(seq id no.5)进行
pcr扩增，获得了与预期大小(486bp)相符的产物，如图5所示。pcr扩增体系为50μl，包括：2
×
super multiplex pcr mix 25μl；10μm primer zmncrg1-f1 2μl；10μm primer zmncrg1-r12μl；dna 1μl,ddh2o 20μl。pcr反应条件为：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃1min,由变性到延伸进行34个循环，终延伸72℃5min)。
36.使用天根生化科技(北京)有限公司的凝胶回收试剂盒(cat.#dp105-3)对pcr产物进行回收和纯化，用北京全式金生物技术有限公司的peasy-blunt cloning kit试剂盒对纯化后的产物进行t载体的连接(载体图谱见图5)，然后转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，使用通用引物t7/sp6进行菌落pcr扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性重组体，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得了486bp的zmncrg1外显子序列，其核苷酸序列见seq id no.1，对应的蛋白质的序列为seq id no.2所示。
37.通过玉米原生质体瞬时表达观察zmncrg1的亚细胞定位，构建载体pcambiasuper1300-gfp-zmncrg1，转化到玉米原生质体中，(1)使用酶解法获得玉米原生质体(2)用适量的mmg溶液重悬原生质体，使终浓度为5
×
105/ml(3)在2ml离心管中加入15μg质粒和200μl原生质体轻柔混匀进行转化(4)转化结束后室温避光存放14～18h(5)制片，用激光共聚焦显微镜观察定位情况证明zmncrg1蛋白定位在叶绿体上如图6所示，从图中可以看出，zmncrg1-gfp定位在质膜上。并且在酵母双杂交实验中证明zmncrg1与zmnir存在相互作用(图7)，(1)构建载体，将目的基因的cdna构建到pgadt7(ad)和pgbkt7(ad)表达载体上；(2)活化酵母ah109菌种，制作酵母感受态；(3)向100μl的酵母感受态细胞内加入10μl ssdna及2μl质粒(约100-200ng)(ad和bd各2μl)，混匀转化；(4)将转化后的菌液涂在2缺和3缺选择培养基上，28℃，倒置培养3天；(5)阳性克隆的鉴定，如果2缺和3缺上都有旺盛生长的酵母，则把2缺上生长的酵母挑取单菌落划在4缺选择培养基上，如果在4缺选择培养基上酵母也可以生长，则证明检测蛋白之间相互作用。zmncrg1与玉米亚硝酸还原酶相互作用说明：亚硝酸还原酶在植物氮同化过程中起重要作用，zmncrg1可能影响植物体内氮的同化从而改变体内硝酸根的含量，在玉米耐低氮过程中发挥重要作用。
38.实施例2玉米氮高效利用基因zmncrg1启动子区域插入的604bp片段的获得
39.为了筛选适合氮高效分子标记的dna序列变异，发明人对197份玉米自交系进行了重测序，通过数据分析和基于pcr产物的测序验证，鉴定到一个抗感材料间存在差异的604bp(具体序列见seq id no.3)插入片段(图3)，命名为zmncrg1-indel。根据全基因组测序数据，发明人设计了一对引物zmncrg1-f1和zmncrg1-r1。引物序列为：
40.zmncrg1-f1：gccgttttcctggaacggt(seq id no.6)；
41.zmncrg1-r1：ctgtgcaccaacaaaaacctaag(seq id no.7)。
42.以zmncrg1-f1和zmncrg1-r1为引物，分别以玉米自交系cimbl144和玉米自交系d340的基因组dna为模板，进行pcr扩增；
43.1.20μl pcr反应体系(2
×
super multiplex pcr mix 10μl,10μm primer zmncrg1-f1μl,10μm primer zmncrg1-r 1μl,dna 1μl,ddh2o 7μl)
44.2.pcr反应条件(预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃30s,由变性到延伸进行34个循环，终延伸72℃5min)，pcr产物交付三博远志公司进行测序分析。测序结果可以表明zmncrg1启动子区域插入序列的长度为604bp。
45.实施例3利用分子标记检测玉米是否为氮高效型
46.选取了197种玉米自交系材料(包括一些玉米骨干自交系)进行检测，检测方法如实施例2所述，利用实施例2中的检测本发明分子标记的引物对，以所述待测玉米基因组dna为模板进行pcr扩增。其结果表明：其中165份自交系pcr产物测序结果表明为氮高效利用型玉米材料，另外32份自交系pcr产物测序结果表明为非氮高效利用型玉米材料。所用自交系名称和鉴定结果如下表所示：
47.48.49.[0050][0051]
在低氮条件下，氮高效基因型材料(无zmncrg1-indel)地上部分的硝酸根含量低于非氮高效基因型材料(有zmncrg1-indel)，说明高效基因型材料的硝酸盐利用效率更高。zmncrg1外显子序列，seq id no.1
[0052][0053]
zmncrg1蛋白序列，seq id no.2
[0054][0055][0056]
一个抗感材料间存在差异的片段序列，seq id no.3
[0057]