一种腈水解酶及其在3-羟基-3-甲基丁酸合成中的应用的制作方法

1.本发明属于生物催化技术领域，涉及一种来源于比林欧文氏菌(erwinia billingiae)的腈水解酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法及其在制备3-羟基-3-甲基丁酸中的应用。


背景技术：

2.3-羟基-3-甲基丁酸(hmb)被用作人类的营养补充剂，特别是在力量和耐力运动中，hmb还可用作药物来治疗肌肉萎缩。此外，hmb还可用作家禽和猪的饲料添加剂或饲料补充剂。
3.ep2744489a1等公开了雅培制药双丙酮醇的次氯酸钠氧化法制备hmb钠盐，进而用盐酸中和制得hmb的技术方案，如式(i)所示。该方案不仅产生化学计量量的盐，还产生大量氯仿等有毒有害物质，且氧化反应的产率较低。
[0004][0005]
利用生物催化法来进行腈的转化，其优势不仅在于反应条件温和、环境污染少，副产物少，还符合原子经济性、绿色环保和可持续发展的要求。
[0006]
cn113646293a公开了赢创化学-酶法级联制备hmb的技术路线，采用商品化的腈水解酶nit59和nit60催化3-羟基-3-甲基丁腈水解制备hmb，37℃条件下反应24小时，转化率26％，生产效率仅为3.28g/l/d。
[0007]
综上，现有腈类物质的生物催化法转化制备hmb仍然存在酶对底物的耐受性差，转化强度不高等问题。限制了其在工业规模的应用。因此，通过基因组数据挖掘等方法开发底物耐受性强的高效腈水解酶，绿色高效地制备hmb具有重要的工业应用价值。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于提供一种腈水解酶及其突变体、编码它们的核酸分子、含有这些核酸分子的载体和细胞，以及它们的制备方法以及利用其作为催化剂，绿色高效水解制备hmb的应用，从而解决现有的腈水解酶催化合成hmb的技术存在的酶对底物的耐受性差，转化强度不高的问题。
[0009]
本发明的发明人从德国微生物菌种保藏中心(dsmz)的菌株保藏编号为dsm 17872的比林欧文氏菌(erwinia billingiae)中获得可以催化3-羟基-3-甲基丁腈水解制备3-羟基-3-甲基丁酸的腈水解酶ebnle，其氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq idno:1所示；通过进一步对腈水解酶ebnle进行分子手段的改造，得到一种将其第126位精氨酸替换为丙氨酸的突变体ebnle-r126a，其氨基酸序列如seq id no:6所示，核苷酸序列
如seq id no:5所示；与ebnle相比，ebnle-r126a的3-羟基-3-甲基丁酸的生产效率显著提高，达29.5g/l/d。
[0010]
在第一方面，本发明提供一种腈水解酶ebnle，其氨基酸序列如seq id no:2所示，其可以催化3-羟基-3-甲基丁腈水解制备3-羟基-3-甲基丁酸。
[0011]
本发明提供的上述腈水解酶ebnle可以是天然、重组或合成的活性多肽，具体地，该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中产生的产物。
[0012]
在一些实施方案中，上述腈水解酶是通过将含有其编码基因的重组载体转化导入大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))构建的重组基因工程菌株，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到腈水解酶。
[0013]
在第二方面，本发明提供一种编码上述腈水解酶的核酸分子，其核苷酸序列如seq idno:1所示。
[0014]
本发明提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。
[0015]
在第三方面，本发明提供上述腈水解酶的突变体，其氨基酸序列如seq id no:6所示，与seq id no:2所示的氨基酸序列相比，其第126位精氨酸突变为丙氨酸，其在3-羟基-3-甲基丁酸的生产效率方面与上述腈水解酶相比有显著提高。
[0016]
本发明提供的上述突变体可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到，如使用重组技术从原核生物(大肠杆菌)中表达获得。
[0017]
在一些实施方案中，上述突变体是通过将含有其编码基因的重组载体转化进入大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))构建重组基因工程菌，然后培养该菌株，并添加诱导剂诱导表达得到突变体。
[0018]
在第四方面，本发明提供一种编码上述突变体的核酸分子，其核苷酸序列如seq id no:5所示。
[0019]
本发明提供的上述核酸分子通常可以通过使用pcr仪扩增或人工合成的方法获得。
[0020]
第五方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
[0021]
在一些实施方案中，上述重组载体为pet26b(+)-ebnle或pet-26b(+)-ebnle-r126a，分别是将编码上述腈水解酶的核酸分子或上述突变体的核酸分子替换pet-26b(+)的bamhi和ecori酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
[0022]
在第六方面，本发明提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。
[0023]
在一些实施方案中，所述重组细胞经诱导后表达上述腈水解酶或突变体。
[0024]
在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：
[0025]
将所述重组载体转化到表达宿主细胞中，经培养并添加诱导剂诱导表达，得到上述腈水解酶或突变体。
[0026]
进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述表达宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组载体可稳定地自行复制，并且其所携带的基因可被有效表达即可，可以为原核生物生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌表达宿主e.coli bl21(de3)。
[0027]
在一些实施方案中，所述重组细胞为重组菌e.coli bl21(de3)/pet-26b(+)-ebnle和重组菌e.coli bl21(de3)/pet-26b(+)-ebnle-r126a，重组细胞可以是重组基因工程菌。重组基因工程菌表达腈水解酶或其突变体时所使用的培养基可以是本领域可以使重组基因工程菌生长并表达本发明的腈水解酶或其突变体的培养基，例如lb培养基。
[0028]
培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，并在适当温度条件下诱导表达腈水解酶及其突变体。优选的培养方法为：将重组菌e.coli bl21(de3)/pet-26b(+)-ebnle或重组菌e.coli bl21(de3)/pet-26b(+)-ebnle-r126a接种至含有卡那霉素的lb液体培养基的试管中，37℃、220rpm培养12小时，按1-2％(v/v)的接种量转接至装有100ml含卡那霉素的lb液体培养基的500ml三角摇瓶中，置于37℃、220rpm培养，当培养液的od
600
达到0.6-0.8时，加入终浓度为100-500μm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，16℃条件下诱导16-24小时后，将培养液离心，收集菌体沉淀，使用生理盐水洗涤，获得重组细胞。
[0029]
更具体地，上述重组细胞的构建方法，包含如下步骤：
[0030]
(1)腈水解酶ebnle的基因的扩增；
[0031]
(2)重组表达质粒pet26b(+)-ebnle的构建；
[0032]
(3)重组表达质粒pet26b(+)-ebnle-r126a的获得；
[0033]
(4)重组表达质粒pet26b(+)-ebnle和pet26b(+)-ebnle-r126a转化进入宿主细胞；
[0034]
(5)平板抗性培养基筛选得到阳性克隆菌株。
[0035]
在第七方面，本发明提供一种腈水解酶或其突变体的制备方法，包括：
[0036]
对上述任一所述的重组细胞进行培养并加入诱导剂诱导，得到培养物；
[0037]
从所述培养物中分离上述腈水解酶或其突变体；
[0038]
其中，对重组细胞进行培养并诱导的方法、将腈水解酶及其突变体从培养物中分离出来的方法均为本领域的常规方法。
[0039]
在第八方面，本发明提供上述腈水解酶、上述核酸分子、上述突变体、上述任一所述的重组载体、上述任一所述的重组细胞和/或上述方法制备得到的腈水解酶或其突变体在制备3-羟基-3-甲基丁酸中的应用。
[0040]
在第九方面，本发明提供一种3-羟基-3-甲基丁酸的制备方法，包括以下步骤：以上述腈水解酶、上述突变体、上述任一所述的重组细胞和/或上述方法制备得到的腈水解酶或其突变体作为催化剂，催化3-羟基-3-甲基丁腈进行水解反应，制备3-羟基-3-甲基丁酸。
[0041]
在一些实施方案中，上述方法中，所述水解反应的温度为30-42℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，其中优选37℃；
[0042]
所述水解反应的ph为6.5-7.5，例如ph6.5、ph7、ph7.5，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选ph7；
[0043]
底物3-羟基-3-甲基丁腈的终浓度为0.01-1m，例如0.01m、0.02m、0.04m、0.06m、0.08m、0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1.0m，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选0.1m。
[0044]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述水解反应使用的缓冲液为本领
域常规缓冲液，例如为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液，其浓度较佳为100mm。
[0045]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，包括用上述任一所述的重组细胞催化3-羟基-3-甲基丁腈进行水解反应，制备3-羟基-3-甲基丁酸；
[0046]
具体地，可以以上述重组细胞的冻干细胞或冻干粉作为催化剂进行全细胞催化生产3-羟基-3-甲基丁酸，冻干细胞或冻干粉的用量为30-90g/g 3-羟基-3-甲基丁腈，可以为60g/g3-羟基-3-甲基丁腈。其中，冻干粉是将上述任一所述的重组细胞进行破碎，获得细胞破碎液，再将细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉，冻干细胞是将重组细胞不经破碎直接冻干得到的。
[0047]
应当理解的是，本发明所述的腈水解酶ebnle或其突变体ebnle-r126a可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的腈水解酶ebnle或其突变体ebnle-r126a制备成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。
[0048]
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述水解反应在搅拌或者振荡的环境下进行，例如在100-500rpm搅拌下反应。
[0049]
本发明的有益效果如下：
[0050]
本发明提供的腈水解酶能够高效催化3-羟基-3-甲基丁腈生成3-羟基-3-甲基丁酸，尤其是突变体ebnle-r126a底物转化率达到99％，3-羟基-3-甲基丁酸的生产效率达29.5g/l/d，对于绿色高效地制备hmb具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
[0051]
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0052]
比林欧文氏菌(erwinia billingiae)来源于德国微生物菌种保藏中心(dsmz)，菌株保藏编号为dsm 17872。
[0053]
pet-26b(+)为novagen公司产品，产品目录号为69862-3cn。
[0054]
实施例1:来源于比林欧文氏菌(erwinia billingiae)dsm 17872的腈水解酶ebnle的基因序列的获得
[0055]
1、提取比林欧文氏菌(erwinia billingiae)dsm 17872的基因组dna。
[0056]
2、以比林欧文氏菌dsm 17872的基因组dna为模板，以ebnle-fp和ebnle-rp为引物进行pcr扩增，得到含有腈水解酶基因的片段，其中，腈水解酶基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，其编码的腈水解酶ebnle的氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0057]
ebnle-fp：5
’‑
cgcggatccatgaacaaaccggttaccgtt-3’(seq id no:3)；
[0058]
ebnle-rp：5
’‑
ccggaattcctactcctcctcttcttgtcc-3’(seq id no:4)。
[0059]
实施例2：腈水解酶ebnle表达菌株的构建
[0060]
1、bamhi和ecori双酶切实施例1获得的含有腈水解酶基因的片段，得到基因片段；bamhi和ecori双酶切pet-26b(+)，得到载体片段；将基因片段和载体片段连接得到重组表达质粒，将其命名为pet26b(+)-ebnle，将该质粒送测序，结果与预期一致。
[0061]
2、将步骤1获得的重组表达质粒pet26b(+)-ebnle通过化学转化的方式转入表达宿主e.coli bl21(de3)中，涂布含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基进行筛选，得到表达腈水解酶ebnle的重组菌e.coli bl21(de3)/pet-26b(+)-ebnle。
[0062]
实施例3：突变体ebnle-r126a的基因序列的获得
[0063]
以实施例2获得的重组表达质粒pet-26b(+)-ebnle作为模板，以ebnle-r126a-fp和ebnle-r126a-rp为引物进行全质粒pcr，引入定点突变，得到突变体重组表达质粒pet26b(+)-ebnle-r126a，其中，腈水解酶突变体的核苷酸序列如seq id no:5所示，其编码的腈水解酶突变体ebnle-r126a的氨基酸序列如seq id no:6所示。
[0064]
ebnle-r126a-fp：5
’‑
accattggaatccgggcg aagcttaaggctacg-3’(seq idno:7)；
[0065]
ebnle-r126a-rp：5
’‑
cgtagccttaagcttcgcccggattccaatggt-3’(seq idno:8)。
[0066]
实施例4：突变体ebnle-r126a表达菌株的构建
[0067]
将实施例3获得的突变体重组表达质粒pet26b(+)-ebnle-r126a，通过化学转化的方式转入表达宿主e.coli bl21(de3)中，涂布含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基进行筛选，获得表达突变体ebnle-r126a的重组菌e.coli bl21(de3)/pet-26b(+)-ebnle-r126a。
[0068]
实施例5：酶的制备
[0069]
分别将实施例2获得的重组菌e.coli bl21(de3)/pet-26b(+)-ebnle和实施例4获得的重组菌e.coli bl21(de3)/pet-26b(+)-ebnle-r126a接种至含有50μg/ml卡那霉素的lb试管培养基中，于37℃、220rpm培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量转接至100ml含有50μg/ml卡那霉素的lb摇瓶培养基中，于37℃、220rpm培养至od
600
＝0.6-0.8，加入终浓度为300μm的诱导剂iptg，于16℃诱导培养20小时，将诱导培养的菌液于9000rpm离心10分钟，收集菌体沉淀，使用生理盐水洗涤，得到静息细胞。将静息细胞直接冻干得到冻干细胞，或经超声破碎后冻干得到冻干粉，并于4℃保存。
[0070]
实施例6：酶催化3-羟基-3-甲基丁酸的制备
[0071]
将实施例5中制得的原始酶ebnle和突变体酶ebnle-r126a作为生物催化剂应用于3-羟基-3-甲基丁酸的制备反应，反应式如下所示：
[0072]
。
[0073]
5ml反应体系：0.1m底物3-羟基-3-甲基丁腈，3.0g冻干细胞(相当于60g/g 3-羟基-3-甲基丁腈)，缓冲液为100mm tris-hcl缓冲液，于37℃，ph 7.0条件下200rpm搅拌反应9.5小时。
[0074]
反应结束后，取1ml反应液离心除去生物催化剂，取上清液经高效液相色谱分析，检测3-羟基-3-甲基丁酸的浓度。经计算，当采用原始酶ebnle作为生物催化剂时，底物3-羟基-3-甲基丁腈转化率(转化率＝(反应物初始的量-反应物剩余的量)/反应物初始的量
×
100％)为31％，产物3-羟基-3-甲基丁酸的生产效率(生产效率＝反应生成的产物的量/(反应时间*催化剂的量))为9.3g/l/d，相比之下，采用突变体酶ebnle-r126a作为生物催化剂
时，底物3-羟基-3-甲基丁腈转化率达99％，产物3-羟基-3-甲基丁酸的生产效率达29.5g/l/d。
[0075]
高效液相色谱检测方法为：
[0076]
采用安捷伦高效液相色谱仪，rp18 grace alltima色谱柱(规格4.5mm
×
250mm)；流动相为0.1m磷酸:乙腈＝9:1(体积比)；流速：1.0ml/min；检测波长：229nm；温度：20℃；所有样品均经10000rpm离心，并经0.22μm有机滤膜过滤，上样量：10μl。
[0077]
3-羟基-3-甲基丁腈标准品的出峰时间为8.9min，3-羟基-3-甲基丁酸标准品的出峰时间为4.5min。
[0078]
反应液中3-羟基-3-甲基丁腈的出峰时间为8.9min，3-羟基-3-甲基丁酸的出峰时间为4.5min。
[0079]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0080]
序列
[0081]
seq id no:1
[0082]
atgaacaaaccggttaccgttgcctgcgttcaggccgcccctgtttttatgaatcttg
[0083]
aaggaaccatagacaaaacgatcgccctcatatcagaagccgcacagaaaggcgcgg
[0084]
agctcatcgcttttcctgagacctggatacccggttatccgtggttcttatggcttaac
[0085]
tcgcccgccattaatatgcccctggtttatcagtatcatcagaactccctcgtgctgga
[0086]
cagtgctcaggcgaagcgaattgcggctgcggcgcagcagaataatatcgttgtggtt
[0087]
ctgggcttcagcgagcgcgatcatggcagcctctatatctcacaatggctgattggaa
[0088]
gcgacggggagaccattggaatccggcgcaagcttaaggctacgcacgtggagcgta
[0089]
cgctgttcggcgaaggcgacggttcctccctgactacctgggagacaccgttgggga
[0090]
acgttggagccctctgctgctgggagcatctgcagccactgtcccgttatgcgatgta
[0091]
ttcccagcatgaggaaatacatatcgccgcctggcccagtttcagtctttacaccagc
[0092]
gcaacggctgcgctggggcccgaggtcaacacggctgcttctcgcctgtatgccgca
[0093]
gagggacaatgcttcgtgatagccccgtgtgccgtggtttctgatgagatgattgattt
[0094]
cctttgtccagatgatgaccgtagggcgttactcagtgccggggggggacatgcccgt
[0095]
atttacggcccggacggaagagaactcgtcacacctctcggggagaatgaggaagg
[0096]
actgcttatcgctgagctcgactctgctgcgattacttttgccaaacttgcggctgac
[0097]
ccgataggccactattcacgtcctgacgtgacccgcctcctttttaatccttcatccaa
[0098]
caagactgtgattaaacggtattcgcctccagagctaattgccgaacaggctggacaa
[0099]
gaagaggaggagtag
[0100]
seq id no:2
[0101]
mnkpvtvacvqaapvfmnlegtidktialiseaaqkgaeliafpetwipgypwflwlnsp
[0102]
ainmplvyqyhqnslvldsaqakriaaaaqqnnivvvlgfserdhgslyisqwligsdge
[0103]
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[0104]
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[0105]
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[0106]
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[0107]
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[0113]
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[0131]
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[0132]
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