一种新型硫化氢荧光探针、制备方法及应用

1.本发明属于探针技术领域，具体是一种新型硫化氢荧光探针、制备方法及应用。


背景技术：

2.硫化氢(h2s)是无色酸性气体，且h2s长期以来一直被认为是生物系统中的有毒分子。近年来，人们开始研究h2s在生理学中的作用，并且认为h2s是第三类内源性气体递质。它与血管舒张、血管新生、细胞凋亡、炎症等疾病密切相关，是人体多种生理活动的重要因素。另外，在哺乳动物体内，当h2s的浓度异常时，会导致老年痴呆症、帕金森病和糖尿病等。因此，发展一种可靠、有效的硫化氢检测方法在生物医学研究和疾病诊断方面具有重要的意义。
3.目前，用比色法、电化学分析法、气相色谱法、金属法等多种方法能够对硫化氢进行测定。但是，这些方法通常耗时、样品准备复杂、破坏测试等。近年来，荧光探针凭借其与目标物质高效准确的结合、响应时间短、无侵入性和与生物系统的兼容性等优点，而得到了迅速的发展。异佛尔酮骨架是一种常用的荧光发光材料，该荧光团合成简单，应用范围广。
4.但是，现有的h2s荧光探针分子其灵敏度较低，选择性较差，相应速度较慢，并且制备方法较为复杂，因此，有必要提供一种新型硫化氢荧光探针。


技术实现要素：

5.本发明提供一种新型硫化氢荧光探针、制备方法及应用，本发明制备了一种检测h2s的新型荧光探针。与现有的h2s荧光探针分子相比，该探针对h2s的灵敏度高、选择性好、响应速度快。同时本发明制备方法简单，检测试剂廉价，过程简便、快速，检测结果准确。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种新型硫化氢荧光探针，结构式如下：
[0007][0008]
一种新型硫化氢荧光探针的制备方法，包括如下步骤：步骤1，化合物1的合成：
[0009]
步骤1，化合物1的合成：
[0010]
称取2g异佛尔酮于容器中，用适量的三氯甲烷，并通过超声处理直至溶解，在混匀的条件下加入1.9g丙二腈，再滴加2滴哌啶，加热到70℃回流搅拌反应12h左右；并且使用第一tlc跟踪反应，其展开剂的体积比为二氯甲烷：甲醇＝10:1，待反应完成后，抽滤，用无水乙醇对滤饼进行重结晶，最终得到纯的化合物1；
[0011]
步骤2，探针合成：
[0012]
称取0.2g的9-蒽甲醛和0.054g化合物1于另一个容器中，向另一个容器中加三氯
甲烷13ml，并通过超声直至溶解，此时反应体系为淡黄色液体，再加2-3滴哌啶，体系变为橙色，常温下反应12h；第二tlc跟踪反应，其展开剂的体积比为石油醚：乙酸乙酯＝3:1，待反应结束后，用5ml水稀释淬灭，冷却，萃取，使用二氯甲烷3
×
20ml，得到的有机层用1mol
·
l-1的盐酸洗涤至酸性ph值为6，得到的有机层为浑浊悬浮物，加无水mgso4干燥，静置30min得到澄清透亮的橙色溶液，抽滤，把滤液旋干，用柱色谱分离纯化，得到探针分子。
[0013]
一种新型硫化氢荧光探针的应用，应用于检测硫化氢的荧光探针。
[0014]
进一步，步骤2中，用柱色谱分离纯化时，所用展开剂分别是石油醚:乙酸乙酯＝1:10、1:8和1:5，其用量比例呈梯度降低。
[0015]
进一步，应用方法包括如下步骤：
[0016]
步骤一，用万分之一分析天平准确称取一定质量的探针，用光谱纯的二甲基亚砜配制成10mm/l的荧光探针储备液；干扰离子等分析物用二蒸水配成母液浓度为100mm/l；
[0017]
步骤二，将3ml乙腈/pbs缓存溶液体系和1.5μl荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待硫化钠溶液的加入，519nm左右的荧光强度逐渐增强；
[0018]
或者，将3ml乙腈/pbs体系和1.5μl荧光探针储备液加入荧光比色皿中，向体系中加入一定体积的干扰离子等分析物母液，待样品溶液孵育30min后，在荧光分光光度计上测试荧光光谱；采用391nm的光辐射作为激发光，记录450-800nm之间的发射光谱；激发和发射光的狭缝宽度都为5.0nm和5.0nm；
[0019]
或者，将3ml乙腈/不同ph体系和1.5μl荧光探针储备液加入荧光比色皿中，测试探针在不同ph下的稳定性和加入硫化钠溶液的变化。
[0020]
进一步，乙腈/pbs缓存溶液体系的条件为10mm/l,ph 7.4，1/1,v/v。
[0021]
进一步，乙腈/不同ph体系的条件为：10mm/l，1/1,v/v。
[0022]
基础方案的原理及有益效果是：经实验验证，相关离子不干扰体系对h2s的测定。本发明的探针可用于h2s的检测。与现有技术相比，本发明作为选择性检测h2s的荧光探针有如下优点：1、本发明的荧光探针的合成方法简单、快速；2、检测手段简单，只需要借助紫外、荧光光谱仪；3、该探针对h2s的灵敏度高、选择性好、响应速度快。
附图说明
[0023]
图1为本发明实施例2中探针加入na2s的紫外变化。
[0024]
图2为本发明实施例3中探针加入na2s的荧光变化。
[0025]
图3为本发明实施例4中探针加入na2s的滴定荧光变化。
[0026]
图4为本发明实施例5中探针对na2s的响应时间。
[0027]
图5为本发明实施例6中荧光探针对不同离子的选择性。
[0028]
图6为本发明实施例7中探针在不同ph下的荧光变化。
具体实施方式
[0029]
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0030]
实施例1，
[0031]
本技术提供一种新型硫化氢荧光探针，其结构式如下：
[0032][0033]
一种新型硫化氢荧光探针的制备方法，包括如下步骤，
[0034]
(1)化合物1的合成：
[0035]
称取2g异佛尔酮(1.0当量)于干净的圆底烧瓶中，用适量的三氯甲烷超声直至溶解，在混匀的条件下加入1.91g丙二腈(1.2当量)，再滴加2滴哌啶，加热到70℃回流搅拌反应12h左右。tlc跟踪反应(二氯甲烷：甲醇＝10:1)，待反应完成后，抽滤，用无水乙醇对滤饼进行重结晶，最终得到纯的化合物1，为奶白色固体1.62g，产率为60％。
[0036]
(2)探针合成：
[0037]
称取0.2g化合物9-蒽甲醛(1.0当量)和0.054g化合物1(1.2当量)于茄形瓶中，加三氯甲烷13ml，超声直至溶解，此时反应体系为淡黄色液体，再加2-3滴哌啶，体系变为橙色，常温下反应12h。tlc跟踪反应(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)。待反应结束后，用5ml水稀释淬灭，冷却，萃取(二氯甲烷3
×
20ml)，可适当加入饱和食盐水缓解乳化现象，得到的有机层用1mol
·
l-1的盐酸洗涤至酸性ph值为6，得到的有机层为浑浊悬浮物，加无水mgso4干燥，静置30min得到澄清透亮的橙色溶液，抽滤，把滤液旋干。使用柱色谱分离纯化，展开剂分别是石油醚:乙酸乙酯＝1:10和1:8和1:5(用量比例呈梯度型)，最终得到探针分子，为淡橙黄色固体0.1g，产率为40％。1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.16(d,2h,ar-h),8.80(d,1h,ar-h),8.23-8.15(m,4h),7.73-7.57(m,5h),2.49(d,4h),1.23(s,4h),0.92(s,2h)。
[0038]
即，具有如下合成路线：
[0039][0040]
一种新型硫化氢荧光探针的应用，应用于检测硫化氢的荧光探针，采用下述实施例来进行检测应用。
[0041]
实施例2荧光探针加入硫化钠(na2s)的紫外变化。
[0042]
在3ml乙腈/pbs缓冲溶液体系(10mm,ph 7.4，1/1,v/v)中加入15μl荧光探针储备液进行紫外实验。随着na2s(终浓度：1820μmol/l)的加入，溶液的紫外光谱图的最大吸收波长发生蓝移，说明探针确实与na2s发生反应。仪器参数:荧光探针溶液的最大激发波长为:λex为391nm。
[0043]
实施例3荧光探针加入na2s的荧光变化。
[0044]
在3ml乙腈/pbs缓冲溶液体系(10mm,ph 7.4，1/1,v/v)中加入1.5μl荧光探针储备液进行荧光实验。在荧光分光光度仪上检测。随着na2s(终浓度：0-1820μmol/l)的加入，519nm左右的荧光强度逐渐增强。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λex为391nm和最大荧光发射波长为:λem为519nm
左右。
[0045]
实施例4探针加入na2s的滴定荧光变化。
[0046]
在3ml乙腈/pbs缓冲溶液体系(10mm,ph 7.4，1/1,v/v)中加入1.5μl荧光探针储备液进行荧光滴定实验。随着不同浓度的na2s加入(终浓度：0-1820μmol/l),探针与na2s的浓度有很好的线性关系，根据usepa(cdl＝3sd/slope)规则，计算得到探针对na2s的检测限为0.13μmol/l。结果表明，探针对硫化钠的灵敏度较高。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λex为391nm和最大荧光发射波长为:λem为519nm左右。
[0047]
实施例5探针对na2s的响应时间。
[0048]
在3ml乙腈/pbs缓冲溶液体系(10mm,ph 7.4，1/1,v/v)中加入1.5μl荧光探针储备液进行响应时间的测定。随着na2s(终浓度：1820μmol/l)的加入，探针的荧光强度不断增强，同时在30s之内响应完全。说明探针对硫化钠的响应速度特别快。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λex为391nm和最大荧光发射波长为:λem为519nm左右。
[0049]
实施例6荧光探针对不同离子的选择性。
[0050]
在3ml乙腈/pbs缓冲溶液体系(10mm,ph 7.4，1/1,v/v)中加入1.5μl荧光探针储备液进行探针对不同离子的选择性测试。1.空白；2.na2s(1.82mm/l)；3.nacl(10mm/l)；4.caco3(10mm/l)；5.al(no3)3(10mm/l)；6.fe(no3)3(10mm/l)；7.mg(no3)2(10mm/l)；8.ca(no3)2(10mm/l)；9.naf(10mm/l)；10.nano3(10mm/l)；11.cu(no3)2(10mm/l)；l2.kmno4(10mm/l)(以上浓度均为终浓度。)分别测其荧光光谱。可以得出探针对硫化钠有专一的响应而不会被其他物质干扰。
[0051]
实施例7探针在不同ph下的荧光变化。
[0052]
在3ml乙腈/pbs缓冲溶液体系(10mm,ph 7.4，1/1,v/v)中加入1.5μl荧光探针储备液进行探针在不同ph的荧光强度的变化测试。探针在不同ph下荧光强度相对比较稳定；随着na2s(终浓度：1820μmol/l)的加入，探针在不同ph条件下荧光强度不断升高，并且在ph＝7响应最好，说明该探针能够在生理条件下对硫化钠进行响应。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λex为391nm和最大荧光发射波长为:λem为519nm左右。
[0053]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本技术给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本技术的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。