D-氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备L-正缬氨酸的方法与流程

本发明涉及生物工程，具体而言，涉及d-氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备l-正缬氨酸的方法。

背景技术：

1、l-正缬氨酸(l-norvaline)是一种非蛋白质支链氨基酸，作为许多药物合成的前体物质，其在制药行业具有非常广泛的应用。培哚普利，作为一种治疗高血压和心力衰竭的有效药物，就是通过以l-正缬氨酸为重要中间体而合成。

2、现有合成l-正缬氨酸的方法有化学法和生物酶法，化学法如专利cn202111031517.3中采用有机合成dl-正缬氨酸后进行酒石酸拆分，最终收率只有36％。还有直接采用dl-正缬氨酸为原料使用酒石酸进行拆分，收率83％，化学法普遍污染较大，且成本较高等缺点。现有技术中生物酶法包括cn202110276664.0采用戊内酰胺盐酸盐为底物，经过水解酶、消旋酶催化制备l-正缬氨酸，原料不易得，不适合工业化生产，在文献《多酶催化拆分dl-正缬氨酸生产l-正缬氨酸》中采用多酶催化，转化率可达96％，但底物浓度最高只有65g/l左右，生产效率低下。

3、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供d-氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备l-正缬氨酸的方法，以改善上述问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种d-氨基酸氧化酶，该d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、第二方面，本发明还提供了一种核酸分子，其用于编码上述d-氨基酸氧化酶，可选地，该核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、第三方面，本发明还提供了上述d-氨基酸氧化酶在酶法制备l-正缬氨酸中的应用。

6、第四方面，本发明还提供了一种酶法制备l-正缬氨酸的方法，其包括：向底物中添加上述d-氨基酸氧化酶，以及过氧化氢酶，进行氧化反应；氧化反应后向反应体系中加入异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶以及异丙醇，用氨水调节ph，并加入醋酸锌和nad+，进行脱氢反应；

7、上述底物为dl-正缬氨酸。

8、本发明具有以下有益效果：

9、本发明为了采用酶法制备l-正缬氨酸，而提供了一种优化后的d-氨基酸氧化酶序列，该酶具有较高的活性和底物耐受度。并通过优化实验条件，确定最佳转化条件，通过该方法能够提高转化率，进而提高生产效率；并且使用该方法的污染小，对环境更友好；同时原料易得，不仅能够降低生产成本，还有利于大规模应用。

技术特征：

1.一种d-氨基酸氧化酶，其特征在于，所述d-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，其用于编码如权利要求1所述的d-氨基酸氧化酶；

3.如权利要求1所述的d-氨基酸氧化酶在酶法制备l-正缬氨酸中的应用。

4.一种酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：向底物中添加权利要求1所述的d-氨基酸氧化酶，以及过氧化氢酶，进行氧化反应；

5.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述底物在反应体系中的浓度50-300g/l；

6.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述底物与d-氨基酸氧化酶的质量比＝1：0.2-0.4；

7.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述过氧化氢酶的添加量为反应体系的0.5-9vt％；

8.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述底物与异丙醇脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、异丙醇和nad+的质量比为1：10％-30％：5％-25％：0.2％-0.6％：0.03％-0.05％；

9.根据权利要求4所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述氧化反应中反应体系的ph＝7-7.5，反应温度为28-32℃；

10.根据权利要求4-9任一项所述的酶法制备l-正缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法还包括在脱氢反应完成后对获得的反应液进行过滤、两次浓缩和干燥，即得到所述l-正缬氨酸；

技术总结
本发明公开了一种D‑氨基酸氧化酶及其应用和酶法制备L‑正缬氨酸的方法，该D‑氨基酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明为了采用酶法制备L‑正缬氨酸，而提供了一种优化后的D‑氨基酸氧化酶序列，该酶具有较高的活性和底物耐受度。并通过优化实验条件，确定最佳转化条件，通过该方法能够提高转化率，进而提高生产效率；并且使用该方法的污染小，对环境更友好；同时原料易得，不仅能够降低生产成本，还有利于大规模应用。

技术研发人员：褚冠武,高仰哲,吴法浩,李钢,王世磊
受保护的技术使用者：安徽红杉生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15