芋螺α螺旋、β折叠抗菌肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，尤其涉及芋螺α螺旋、β折叠抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、近年来，由于传统抗生素的滥用，导致细菌耐药性的问题日益严重，寻找新的抗生素变得越来越困难。抗菌肽（antimicrobial peptide）原指动、植物体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的多肽物质，是宿主防御肽，其具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，是目前最具有潜力替代抗生素的一类生物资源。抗菌肽的抑菌机理是：大多数的抗菌肽是阳离子（带正电荷）和两亲（亲水和疏水）α螺旋/β折叠肽分子，基于膜渗透性，阳离子抗菌肽可以与带负电的细胞膜结合并相互作用，使细胞膜上电化学电位产生变化，诱导细胞膜损伤使蛋白质等较大分子进行渗透，破坏细胞形态和细胞膜，最终导致细胞死亡。因此，与传统抗生素相比不易产生耐药性，作为治疗药物具有很好的开发前景。

2、目前，据报道已经从动物、真菌、植物和细菌中鉴定出超过3000个抗菌肽，例如：来自5种蚂蚁的15条毒液短肽序列被报道具有抗菌活性；来自7种蜜蜂的13条毒液短肽序列被报道具有抗体活性；来自9种蛇的10条毒液短肽序列被报道具有抗体活性；来自30余种蜈蚣中发现了55条具有活性的抗菌肽等。

3、芋螺（ cone snail）又名鸡心螺，是一种肉食性海洋腹足纲软体动物，以其美丽的外壳和体内分泌的特殊毒素而闻名。目前登记在册的芋螺约有1000余种，其通过毒液捕食蠕虫、蜗牛或鱼类等各种动物。芋螺毒素的化学结构新颖、生物活性强、靶向选择性高，因此其也是具有吸引力的新药资源。在过去的几十年里，已经发现了超过70,000种天然芋螺毒素，广泛用于药理学和神经科学研究。

4、然而，与蠕虫、蜗牛、鱼类等这些动物相比，关于芋螺多肽抗菌功能的研究较少，目前只有几条相关的芋螺多肽序列被报道具有抗菌功能，且对这些芋螺抗菌肽的抗菌应用研究更是极为稀少。例如，其中一项研究报道是一种来自芋螺o1超家族的conotoxin可以抑制结核分枝杆菌的生长，另一项报道是一种来自芋螺ω-conotoxin的开链mviia结构可以抑制真菌的生长。此外，现有的抗菌肽大多数为盲目筛选获得，例如通过实验手段直接从生物分离提取，或将获得的抗菌肽基因序列克隆后导入微生物培养，然后再通过一系列的实验手段进一步分离纯化和鉴定。例如，中国专利文献cn115232850a公布的海洋生物抗菌肽的制备方法，通过将海洋生物材料冻干粉碎后，再进行酶解，分离提取抗菌肽；中国专利文献cn115057918a公布的美洲鳗鲡新型抗菌肽的体外重组表达及鉴定，从美洲鳗鲡中克隆到杀菌蛋白的抗菌结构域基因，然后构建表达载体，导入大肠杆菌进行表达，然后再进行使用色谱纯化柱进行层析纯化后进一步鉴定。这些方法不仅实验流程多，操作繁琐，而且耗费时间长，效率低下，成本也高，不利于抗菌肽的开发研究及应用。

5、因此，如何快速有效地深入挖掘芋螺多肽的抗菌功能，并获取更多的芋螺抗菌肽，为取代传统抗生素治疗药物提供更多选择，具有重要的研究意义和潜在的市场价值。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题及为了达到上述的目的，本发明提供一种芋螺α螺旋、β折叠抗菌肽及其制备方法和应用，结合生物信息学技术，从桶形芋螺（ conus betulinus）多组学数据集中筛选三条抗菌肽前体基因核酸序列，根据该三条核酸序列翻译成的氨基酸序列进行人工筛选设计芋螺抗菌肽的抗菌活性区域并进行化学合成，再经抗菌活性验证鉴定后获得三种新型芋螺抗菌肽。具体技术方案如下：

2、首先，本发明提供从桶形芋螺（ conus betulinus）多组学数据集中识别筛选的三条芋螺抗菌肽前体基因，其核酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示。

3、其次，本发明提供基于前述三条芋螺抗菌肽前体基因的芋螺抗菌肽前体蛋白，其氨基酸序列根据密码子编码规则确定，分别如下：

4、基于seq id no.1核酸序列确定的芋螺抗菌肽前体蛋白氨基酸序列如seq idno.4所示；

5、基于seq id no.2核酸序列确定的芋螺抗菌肽前体蛋白氨基酸序列如seq idno.5所示；

6、基于seq id no.3核酸序列确定的芋螺抗菌肽前体蛋白氨基酸序列如seq idno.6所示。

7、再次，本发明提供根据确定的芋螺抗菌肽前体蛋白氨基酸序列，结合已知的抗菌肽抗菌活性多肽片段，人工筛选设计芋螺抗菌肽菌活性域，获得芋螺抗菌肽氨基酸序列，再经化学方法合成的芋螺抗菌，设计的芋螺抗菌肽氨基酸序列为：

8、基于氨基酸序列为eq id no.4的芋螺抗菌肽前体蛋白设计的芋螺抗菌肽氨基酸序列如seq id no.7所示；

9、基于氨基酸序列为seq id no.5的芋螺抗菌肽前体蛋白设计的芋螺抗菌肽氨基酸序列如seq id no.8所示；

10、基于氨基酸序列为seq id no.6的芋螺抗菌肽前体蛋白设计的芋螺抗菌肽氨基酸序列如seq id no.9所示。

11、从次，本发明提供一种芋螺抗菌肽的制备方法，该方法用于制备前述的任意一种芋螺抗菌肽；具体步骤如下：

12、1）选取芋螺多组学数据集，所述多组学数据集包括芋螺基因组、转录组和毒液蛋白组数据集；

13、2）通过同源比对和活性模拟预测，从所述多组学数据集中筛选芋螺抗菌肽前体基因序列，如seq id no.1～seq id no.3所示；

14、3）将筛选的抗菌肽前体基因序列翻译成相应的芋螺抗菌肽前体蛋白序列，如seqid no.4～seq id no.6所示；

15、4）参照已知抗菌活性的抗菌肽多肽片段，对芋螺抗菌肽前体蛋白进行潜在成熟活性肽区域设计，得到氨基酸序列如seq id no.7～seq id no.9所示的多肽；

16、5）采用化学合成方法，合成seq id no.7～seq id no.9所示的多肽；

17、6）鉴定所合成的多肽的抑菌效果，从而获得具有抗菌活性的芋螺多肽，即芋螺抗菌肽。

18、作为优选的技术方案的，步骤4）中，所述对芋螺抗菌肽前体蛋白进行潜在成熟活性肽区域设计所得到的多肽符合以下条件：

19、a. 其为带有正电荷的阳离子；

20、b. 其等电点大于8.0；

21、c. 其ctdd和paac值大于0.5；

22、d. 其具有α螺旋和/或β折叠；

23、e. 其氨基酸序列中半胱氨酸数量少于5个；

24、f. 其氨基酸序列长度不超过30个氨基酸。

25、作为优选的技术方案的，步骤6）中，所述鉴定所合成的多肽的抑菌效果为将合成的多肽与包括实验用大肠杆菌和毕赤酵母菌在内的不同微生物混合培养，验证其抗菌活性。

26、另外，本发明还提供一种芋螺抗菌肽的应用，即为前述的任意一种或几种芋螺抗菌肽在制备具有抗菌活性产品中的应用。

27、优选的，所述具有抗菌活性产品能够特异性抑制毕赤酵母菌和/或大肠杆菌的生长。

28、另外，本发明提供一种用于杀菌的制剂，该制剂成分含有前述的任意一种或几种芋螺抗菌肽作为有效成分。

29、优选的，该制剂含有浓度为917μm氨基酸序列如seq id no.7所示的芋螺抗菌肽；或含有浓度为245μm～491μm氨基酸序列如seq id no.8所示的芋螺抗菌肽，优选浓度为245μm和491μm；或含有浓度为39μm～312μm氨基酸序列如seq id no.9所示的芋螺抗菌肽，优选浓度为78μm、39 μm、156μm、312μm。

30、本发明的有益效果：

31、1）本发明从芋螺多组学数据集中挖掘出三种芋螺抗菌肽，并首次发现了其可抗两种不同真菌和细菌的作用，强调了芋螺多肽的抗菌潜力，其中ubi_31-38和ccamp1-cb均能抑制真菌毕赤酵母的生长，yfgap-cb对大肠杆菌表现出抑制活性，丰富了芋螺抗菌肽的种类及抑菌种类，并有望将其应用制备具有抗菌活性的产品并代替抗生素用于临床中真菌或细菌感染的治疗，具有良好的应用前景及经济价值。

32、2）本发明首次采用多组学数据集（基因组、转录组、蛋白组）挖掘技术，从芋螺多组学数据集中一次性挖掘设计多种抗菌肽序列，并通过化学方法直接合成抗菌肽蛋白，有效解决了传统抗菌肽筛选过程中存在的盲目筛选、效率低、成本高的问题，为芋螺遗传资源的开发利用提供新的研究方法。

33、3）本发明的结合生物信息学技术，直接从生物学大数据层面筛选潜在的目标序列，结合活性模拟预测与体外实验验证的方法，为深入开发宝贵的生物遗传资源提供了新思路，并为将新型海洋抗菌药物应用于临床治疗提供了坚实的理论基础。