基于CRISPR/Cas9的人源化ATXN3基因敲入小鼠模型的构建方法及应用

本发明涉及生物，特别涉及一种基于crispr/cas9的人源化atxn3基因敲入小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、遗传性脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxias，scas)是一类临床和遗传异质性较高的遗传性神经退行性疾病，其患病率约为0-5.6/10万。目前已报道了49种sca亚型，其中以脊髓小脑性共济失调3型(又称马查多-约瑟夫病)(spinocerebellar ataxiatype 3/machado-joseph disease，sca3/mjd，以下简称sca3)最为常见，约占中国所有scas的60-70％。

2、sca3由位于14q32区域的atxn3基因10号外显子内cag三核苷酸重复序列异常扩增所致。正常人群中cag重复序列拷贝数为12-44次，而在sca3患者中为52-86次，因此导致编码的ataxin-3蛋白内多聚谷氨酰胺肽链(polyglutamine,polyq)异常扩展。异常扩展的polyq蛋白将在小脑、脑干、脊髓等部位的神经元细胞核内选择性聚集，并形成神经元核内包涵体(neuronal intranuclear inclusions，niis)，引起神经元变性及死亡，最终导致上述部位萎缩。该类由异常扩展的polyq突变蛋白引起的疾病称为polyq病，包括sca1、2、3、6、7、17，脊髓延髓肌肉萎缩症(spinal and bulbar muscular atrophy，sbma)，齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy，drpla)，亨廷顿病(huntington’s disease，hd)。

3、sca3是9种polyq病中最具有代表性的一种，其临床表型复杂，核心症状为小脑性共济失调。步态异常是最常见的首发症状，主要表现为醉酒样步态，同时可伴构音障碍、眼球震颤、吞咽困难、饮水呛咳以及自主神经功能障碍、睡眠障碍、认知障碍等神经系统表现。影像学主要表现为小脑和脑干萎缩，可伴有第四脑室扩大。该病发病机制尚未被完全阐明，可能的机制包括毒性蛋白片段假说、细胞内蛋白稳态失衡假说、线粒体功能障碍假说、基因转录和表达失调假说、囊泡及轴突传递障碍假说、神经信号传导异常假说等，导致目前尚无特效治疗。构建理想的疾病动物模型对于sca3的发病机制探索、治疗靶点发现和药物疗效评估至关重要。由于与人源基因相似度高、价格低、繁殖力强、存活能力强、遗传操作便利等优点，小鼠模型是该病最重要的模式生物之一。

4、既往sca3小鼠模型的构建主要基于转基因技术和胚胎干细胞(embryonicstemcell,es)打靶技术。转基因小鼠模型的构建一般是指通过原核显微注射的方法，将外源性目的基因注射到小鼠受精卵使之整合到小鼠基因组中，并在外源性启动子作用下过表达目的基因，其主要优势是可插入大片段目的基因。2002年cemal等利用酵母人工染色体(yeast artificial chromosomes，yac)作为转基因载体，向小鼠受精卵中转入了含cag重复序列拷贝数为84次的人源atxn3基因cdna全长片段，构建了mjd84.2转基因小鼠模型，但该模型表型出现时间较晚，15月龄才出现平衡障碍及肢体协调功能受损，不能很好地模拟sca3患者的疾病特征。另外，由于目的基因的插入位点不可控，所以基于原核注射的转基因技术会导致目的基因随机整合，造成基因组发生重排、易位、缺失等突变，影响小鼠其它内源性基因的表达。而且，转基因技术用来控制目的基因表达的启动子为外源性人工启动子，该启动子虽能使目的基因过表达，但可能缺乏组织和时间的特异性，对动物的生理功能造成影响，进而影响疾病表型的出现。

5、es打靶小鼠模型的构建一般先在小鼠es细胞中通过同源重组将外源性目的基因定点整合入es细胞基因组中，并将整合后的es细胞注射到囊胚腔中形成嵌合胚胎，将嵌合胚胎移植到假孕鼠体内发育成嵌合体小鼠，嵌合鼠再与野生型小鼠杂交将es细胞中的基因编辑信息传递给子代小鼠。基于同源重组的es打靶技术极大降低了脱靶率。2015年ramani等基于es打靶技术构建了atxn3q82/q6基因敲入(knock-in，ki)sca3小鼠模型，该小鼠模型的atxn3基因座中定点插入了82次cag重复序列，虽然能有效模拟sca3患者的病理改变，但未能出现sca3相关行为学表型，因此该模型仅可用于sca3神经元损伤和症状前期分子机制研究。同期，switonski等通过用含91次cag重复序列的人源化atxn3基因取代小鼠内源性atxn3基因构建了sca3-ki91小鼠。与atxn3q82/q6小鼠模型不同的是，sca3-ki91小鼠模型存在浦肯野细胞丢失和共济失调表型，但表型出现时间较晚，疾病表型轻微，且由于该模型只置换了atxn3基因的7-11号外显子，因此不能完全模拟sca3患者的遗传背景。此外，es打靶技术存在操作复杂、打靶效率低下及成本高等缺点。鉴于以上问题，探究新的sca3疾病模型构建技术至关重要。

技术实现思路

1、本发明为了解决上述技术问题，提供了一种基于crispr/cas9的人源化atxn3基因敲入小鼠模型的构建方法及应用。

2、本发明是通过以下技术方案得以实现的。

3、一种基于crispr/cas9的人源化atxn3基因敲入小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

4、目的基因序列及重组质粒的合成：构建含96次cag三核苷酸重复的目的atxn3-96q-cds序列，atxn3-96q-cds序列如seq id no.1所示；将合成的目的基因序列导入质粒载体，构建重组质粒，将验证正确的重组质粒作为donor载体；

5、设计5’端和3’端的两条grna序列：5’端grna序列如seq id no.2所示，3’端grna序列如seq id no.2或seq id no.3所示；

6、cas9/grna/donor的显微注射：将cas9、grna以及含有目的基因序列的donor载体显微注射到小鼠受精卵中，再将受精卵移植到假孕母鼠，构建得到f0代首建鼠(ki-96q小鼠模型)。

7、一种上述构建方法得到的crispr/cas9的人源化atxn3基因敲入小鼠模型在研究遗传性脊髓小脑性共济失调发病机制中的应用。

8、一种上述构建方法得到的crispr/cas9的人源化atxn3基因敲入小鼠模型在发现遗传性脊髓小脑性共济失调治疗靶点中的应用。

9、一种上述构建方法得到的crispr/cas9的人源化atxn3基因敲入小鼠模型在评估治疗遗传性脊髓小脑性共济失调药物疗效中的应用。

10、本技术具有以下有益效果。

11、(1)本发明基于crispr/cas9技术成功构建的ki-96q小鼠模型是致病基因完全人源化的小鼠模型，可以更好地模拟人源性目的蛋白的功能；

12、(2)本发明构建的ki-96q小鼠模型行为学表型出现早，表现出进行性加重的运动及平衡功能失调，目前表型稳定，能有效模拟临床上sca3患者的遗传及临床特点；

13、(3)本发明构建的ki-96q小鼠模型具有包涵体形成和浦肯野细胞受损等sca3主要神经病理改变特征，能有效模拟临床上sca3患者的病理特点；

14、(4)本发明构建的ki-96q小鼠模型具有以小脑、脑桥体积减少为主，同时伴有第四脑室扩大的影像学改变，能有效模拟临床上sca3患者的神经影像特征；

15、(5)本发明构建的ki-96q小鼠模型将进一步动态观察，以绘制sca3不同疾病阶段的表型图谱；

16、(6)本发明构建的ki-96q小鼠模型为后续sca3的发病机制及治疗研究提供了有效工具；

17、(7)本发明构建的ki-96q小鼠模型将应用于探索神经元选择性死亡的发病机制，解析sca3相关分子及环路调控机制，整合分析空间转录组学、蛋白质组学等多组学变化，筛选sca3相关修饰基因及通路；

18、(8)本发明构建的ki-96q小鼠模型将应用于sca3的间充质干细胞移植、小分子化合物药物筛选、rna干扰等治疗研究，为sca3的精准治疗和新药开发提供有效工具和新靶点。