高产香兰素工程菌大肠杆菌的构建的制作方法

本发明涉及高产香兰素工程菌大肠杆菌的构建，属于微生物发酵。

背景技术：

1、香兰素(vanillin,va)是阿魏酸(ferulicacid,fa)的衍生物之一，又名甲基原儿茶醛、香兰醛、香草醛，其化学名称为3-甲氧基-4羟基苯甲醛(3-methoxy-4-hydrobenzaldehyde)，分子式为c8h8o3，相对分子质量为152.12。香兰素是一种应用广泛的带有酚羟基和醛基的芳香类物质，具有独特而浓郁的芳香气味。由于兼具酚羟基和醛基，因此既可进行醛基的氧化还原反应，又可发生酚羟基和芳环反应。香兰素用途十分广泛，是世界上最重要的香料之一，被赋予“食品香料之王”的美誉，应用于化妆品、食品、医药、农业、塑料等多个领域。截止2019年，香兰素的全球年需求量达1.7万吨，并且在不断增加，可见广谱性香料香兰素扮演着重要角色。目前，香兰素主要有从天然植物提取、化学合成以及生物转化3种方法制备。天然植物提取的香兰素是最天然、最绿色安全的产品，但其产量低、周期长、资源有限、价格昂贵，不能单独满足市场需求；化学合成是一种替代方法，虽经济快速，但会导致环境污染，而且它缺乏基质选择性，从而降低加工效率，增加下游加工成本。根据美国和欧盟法规(ecno.1334/2008)，只有fda认可的利用生物法转化天然原料得到的香兰素，才能被认为是天然香兰素，天然和生物技术生产的香兰素被世界上大多数食品控制局认为是食品级添加剂。因此生物法制备香兰素成为了最有应用前景的天然香兰素生产方法。基于生物技术的手段，通过微生物转化适宜的底物前体如丁香酚、异丁香酚、阿魏酸等来生产香兰素，利用真菌、细菌或基因工程菌生物合成成为非常有前景的发展趋势。

2、阿魏酸是生物法制备香兰素最具潜力的底物，与丁香酚相比，阿魏酸来源广泛，是最丰富的酚类化合物之一，且其对微生物的毒性作用更小。很多微生物均可将阿魏酸转化为香兰素，但通过这些微生物所产生的香兰素很快被降解为其他化合物，或者被作为能源和碳源消耗掉。大肠杆菌因其清晰的遗传背景，简单的基因操作，且所需培养基成分简单，生长速度快、适合用于大规模发酵等优势，成为基因工程改造的常用菌，因此可认为大肠杆菌是一种发酵生产香兰素的有前途的微生物。大肠杆菌并不是香兰素生产的野生菌，需将生产香兰素所需基因克隆到大肠杆菌细胞内。

3、经过调研，目前利用大肠杆菌异源表达香兰素合成基因，通过全细胞催化完成阿魏酸到香兰素转化的研究中，江南大学利用高密度发酵生产的产量最高，约为4.27g/l，仍远不能满足需求，所以如何大量生产安全天然的香兰素成为亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种适用于高密度发酵生产天然香兰素的重组菌，通过发酵条件、上罐条件等的摸索，实现高效合成，满足市场对于香兰素的需求。

2、本发明的第一个目的是提供一种生产香兰素的重组菌，以大肠杆菌为宿主，过表达阿魏酰辅酶a合酶和烯酰辅酶a水合酶/醛缩酶。

3、在一种实施方式中，所述阿魏酰辅酶a合酶来源于拟无枝酸菌属amycolatopsissp.atcc39116或来源于土壤原核细菌soilprokaryoticbacteria，所述烯酰辅酶a水合酶/醛缩酶来源于荧光假单孢菌pseudomonasfluorescens。

4、在一种实施方式中，编码所述阿魏酰辅酶a合酶的基因的核苷酸序列如seq idno.2或seq id no.3所示，编码所述烯酰辅酶a水合酶/醛缩酶的基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。

5、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌bw25113或大肠杆菌bl21(de3)。

6、在一种实施方式中，所述重组菌以pbad-hisa为载体。

7、在一种实施方式中，编码所述阿魏酰辅酶a合酶的基因由启动子arabad起始表达。

8、在一种实施方式中，所述启动子arabad的核苷酸序列如seq id no.9所示。

9、本发明的第二个目的是提供一种全细胞催化剂，含有上述重组菌。

10、本发明的第三个目的是提供一种高效合成香兰素的方法，所述方法为，以上述重组菌或上述全细胞催化剂为发酵菌，以阿魏酸为底物，在含有诱导剂的反应体系中生产香兰素。

11、在一种实施方式中，将上述重组菌或上述全细胞催化剂的种子液接种于发酵培养基中，待od达到20～40，加入诱导剂培养10～15h，随后流加阿魏酸，发酵10～15h，发酵过程中全程流加葡萄糖。

12、在一种实施方式中，以2～6g/l/h的速度流加80～120g/l阿魏酸。

13、在一种实施方式中，以2～6ml/l/h的速度流加400～600g/l葡萄糖。

14、在一种实施方式中，所述诱导剂为l-阿拉伯糖或iptg。

15、本发明还提供了上述重组菌或上述全细胞催化剂或上述方法在化妆品、食品、医药、农业、塑料领域中的应用。

16、本发明还提供了上述重组菌或上述全细胞催化剂或上述方法在制备香兰素或含有香兰素的产品中的应用。

17、有益效果：

18、本发明选择大肠杆菌作为表达代谢宿主，通过筛选出在大肠杆菌中异源表达时具有催化活性显著高于目前已报道的其他物种来源的阿魏酰辅酶a合酶，并共表达出香兰素合成通路中的关键基因(如图1)。本发明从不同物种来源香兰素合成过程的关键基因-阿魏酰辅酶a合酶基因(feruloyl-coasynthetase，fcs)中，筛选到了来自拟无枝酸菌属的amycolatopsissp.atcc39116的阿魏酰辅酶a合酶基因(atfcs)和土壤原核细菌soilprokaryoticbacteria的阿魏酰辅酶a合酶基因(spbfcs)，在大肠杆菌中异源表达时，该酶的催化活性显著高于目前已报道的其他物种来源的阿魏酰辅酶a合酶。在大肠杆菌中异源表达fcs基因和ech基因，在大肠杆菌中构建香兰素合成途径，通过全细胞催化完成阿魏酸到香兰素的转化。由此构建得到香兰素高效生物合成工程菌，通过摇瓶培养发酵液中香兰素含量达698mg/l和450mg/l，其中，异源表达atfcs和ech基因的工程菌在发酵罐中香兰素产量达到10.695g/l，实现了香兰素在大肠杆菌中的高效合成，具有良好的工业化应用前景。

技术特征：

1.一种生产香兰素的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，过表达阿魏酰辅酶a合酶fcs和烯酰辅酶a水合酶/醛缩酶ech；所述阿魏酰辅酶a合酶fcs来源于拟无枝酸菌属amycolatopsis sp.atcc 39116或来源于土壤原核细菌soilprokaryotic bacteria，所述烯酰辅酶a水合酶/醛缩酶ech来源于荧光假单孢菌pseudomonasfluorescens。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，编码所述阿魏酰辅酶a合酶fcs的基因的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示，编码所述烯酰辅酶a水合酶/醛缩酶ech的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌bw25113或大肠杆菌bl21(de3)。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，编码所述阿魏酰辅酶a合酶的基因由启动子arabad起始表达。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述启动子arabad的核苷酸序列如seqid no.9所示。

6.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1～5任一所述重组菌。

7.一种高效合成香兰素的方法，其特征在于，所述方法为以权利要求1～5任一所述重组菌或权利要求6所述的全细胞催化剂为发酵菌，以阿魏酸为底物，在含有诱导剂的反应体系中生产香兰素。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将权利要求1～5任一所述重组菌或权利要求6所述的全细胞催化剂的种子液接种于发酵培养基中，待od达到20～40，加入诱导剂培养10～15h，随后流加阿魏酸，发酵10～15h，发酵过程中全程流加葡萄糖。

9.权利要求1～5任一所述重组菌或权利要求6所述全细胞催化剂或权利要求7或8所述方法在化妆品、食品、医药、农业、塑料领域中的应用。

10.权利要求1～5任一所述重组菌或权利要求6所述全细胞催化剂或权利要求7或8所述方法在制备香兰素或含有香兰素的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了高产香兰素工程菌大肠杆菌的构建，属于微生物发酵技术领域。本发明从不同物种来源中筛选到了香兰素合成过程的关键基因之一‑阿魏酰辅酶A合酶基因(Feruloyl‑CoAsynthetase，fcs)，并与阿魏酰辅酶A水解酶/醛缩酶(Feruloyl‑CoA hydratase/aldolase,ech)在大肠杆菌中异源共表达，通过全细胞催化完成阿魏酸到香兰素的转化。本发明筛选到了可在大肠杆菌中具有高催化活性的阿魏酰辅酶A合酶基因，在大肠杆菌中构建了香兰素合成途径，并通过发酵条件等优化，建立了高产香兰素的大肠杆菌菌株及方法。

技术研发人员：张山,肖运柱,潘朝智,陈永丽
受保护的技术使用者：深圳中科欣扬生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13