一种合成多肽及其在促进皮肤愈合中的应用

1.本发明属于多肽及其合成的技术领域，具体地说涉及一种合成多肽及其在促进皮肤愈合中的应用。


背景技术：

2.皮肤作为机体的第一道保护屏障，极易受到创伤。若对皮肤创口处理不当，极容易导致皮肤创口感染或瘢痕增生等不良后果。因此，如何有效地促进皮肤创伤修复是研究者们面临的一个巨大挑战。伤口愈合是一个复杂的生物学过程，是恢复皮肤屏障完整性的关键因素。
3.生物活性肽对维持机体的生理活动和稳定发挥着不可或缺的作用。生物活性肽丰富的功能是当代较为热门的研究方向，其中从动植物中等分离提取出的生物活性肽的功能备受关注，其不但在皮肤创伤愈合中发挥积极作用，而且具有良好的生物功能，同时因具有微量、安全、高效等特点，被广泛地应用在医药健康等领域。然而，目前，对生物活性肽在皮肤创伤愈合发挥作用的相关研究中还存在一些问题，如生物活性肽的制备多使用传统的酶解法，得到的产物多为混合物，对生物活性肽功能分子的解析研究不充分；活性肽的分子量较小，有效的分离、纯化手段也成为了其研究和工业化生产的制约性因素。关于生物活性肽，在考虑其对皮肤创伤愈合的作用效果的同时，也应考虑到所得产物对皮肤刺激性的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种合成多肽及其在促进皮肤愈合中的应用，本发明的合成多肽对于伤口愈合具有良好的治疗作用，安全性好，疗效显著。
5.本发明首先提供一种合成多肽，其特征在于，所述的合成多肽的氨基酸序列如下：
6.gly-pro-ser-gly-gly-gly-tyr-asp-phe-gly-leu-pro-gly-ala-pro-gly-phe-val-gly(gpsgggydfglpgapgfvg)(seq id no:1)；
7.本发明还提供上述的合成多肽的衍生多肽，其包含有：
8.1)在seq id no:1的多肽上取代、缺失、添加一个或几个氨基所获得的多肽；
9.2)将seq id no:1的多肽进行截短所获得的多肽；
10.3)将1)或2)中的多肽进行串联所获得的多肽；
11.作为实施例的具体记载，所述的衍生多肽的氨基酸序列如下：
12.gly-leu-pro-gly-val-pro-gly-phe-val-gly(glpgvpgfvg)(seq id no:2)；
13.gly-pro-ser-gly-gly-gly-tyr-asp-phe-gly-leu-pro-gly(gpsgggydfglpg)(seq id no:3)；
14.gly-leu-pro-gly-val-pro-gly-phe(glpgapgf)(seq id no:4)。
15.本发明再一个方面还提供一种偶联多肽，为上述的合成多肽与功能性分子的偶联产物；
16.所述的功能性分子为能够增强所述的合成多肽功效的分子，例如多肽或多糖；
17.本发明另一个方面还提供所述的合成多肽的一种用途，是在制备促进伤口愈合药物、皮肤修复术后医疗器械、皮肤修复术后用品、皮肤修复保健品或皮肤修复化妆品中的用途。
18.本发明还提供一种具有促进伤口愈合药物或皮肤修复功能的制品，所述的制品中包含有上述的合成多肽，或其衍生多肽中的任一个或几个。
19.本发明的合成多肽具有明显的促进伤口愈合活性，可用于加速体表皮肤的创口愈合，减少疤痕产生。因此，本发明的合成多肽具有优异的促进伤口愈合活性，可用于具有修复皮肤功能的药品、术后医疗器械、保健品、化妆品等的生产原料或敷料，具有广阔的应用前景。
附图说明
20.图1：多肽对小鼠创面愈合的影响照片图；
21.图2：序列为seq id no:1的多肽对小鼠胚胎成纤维细胞nih 3t3细胞增殖的影响图，与空白对照相比，*p《0.05，**p《0.01；
22.图3：序列为seq id no:1的多肽对小鼠胚胎成纤维细胞nih 3t3细胞迁移的影响照片图，其中左图为空白对照；右图为seq id no:1的多肽。
具体实施方式
23.本发明对从鹿茸中酶解制备的，具有促进皮肤愈合效果的多肽混合物采用反相液相色谱对鹿茸多肽进行分离纯化，采用eclipse xdb-c18色谱柱纯化，测序获得具有促进皮肤愈合的多肽，其氨基酸序列为gpsgggydfglpgapgfvg(seq id no:1)。
24.本发明还提供seq id no:1的合成多肽的衍生多肽，其包含有：
25.1)在seq id no:1的多肽上取代、缺失、添加一个或几个氨基所获得的多肽；
26.2)将seq id no:1的多肽进行截短所获得的多肽；
27.3)将1)或2)中的多肽进行串联所获得的多肽；
28.其中1)是与seq id no:1具有高同源性的衍生多肽，也具有促进皮肤愈合的功效；
29.2)是对seq id no:1的多肽进行截短后获得的多肽，也具有促进皮肤愈合的功效；例如氨基酸序列为glpgvpgfvg(seq id no:2)、氨基酸序列为gpsgggydfglpg(seq id no:3)和氨基酸序列为glpgapgf(seq id no:4)。
30.3)是对上述的seq id no:1的多肽，或1)与2)中的多肽任选两个或三个进行串联获得的偶联多肽，
31.所述的偶联多肽还可以是将上述的多肽与功能性分子进行偶联获得的产物。
32.所述的功能性分子为能够增强所述的合成多肽功效的分子，例如3
′
加上多肽或多糖。
33.本发明另一个方面还提供所述的合成多肽的一种用途，是在制备促进伤口愈合药物、皮肤修复术后医疗器械、皮肤修复术后用品、皮肤修复保健品或皮肤修复化妆品中的用途。
34.本发明还提供一种具有促进伤口愈合药物或皮肤修复功能的制品，所述的制品中
包含有上述的合成多肽，或其衍生多肽中的任一个或几个。
35.本发明所提供的多肽可采用常规的合成方法，如液相分段合成法、固相合成、生物合成法，作为本发明所述多肽的优选实施方案，所述多肽采用固相多肽合成工艺合成多肽。为确保生物安全性，本发明多肽的纯度≥95％。可采用hplc对产物进行纯化。
36.本发明所提供的多肽及衍生产物可用于制备皮肤缺损和难愈合性皮肤溃疡治疗的药物。
37.进一步地，所述皮肤缺损和难愈性皮肤溃病可以是炎症、溃疡、严重烧伤、创伤、肿瘤术后以及先天性畸形等多种急慢性损伤引起的大面积的皮肤缺损和难愈性皮肤溃疡。
38.下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
39.实施例1：合成多肽
40.对氨基酸序列为seq id no:1-4的多肽分别进行合成，具体步骤如下：
41.树脂溶胀：将树脂放入150ml反应柱中，并加入50ml dcm浸泡2h，使用dmf洗涤树脂，抽干，重复四次，完成树脂溶胀。脱保护：称取fmoc-c端第一个氨基酸(带保护)、dcm、diea加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应2h。用甲醇溶液封闭(甲醇：diea：dcm＝1:1:2)半小时，然后用dmf洗涤四次，抽干。向反应器中加入20％哌啶溶液，脱去fmoc保护基团。脱完保护后用dmf洗涤四次，然后抽干。取少量树脂用茚三酮法检测，树脂有颜色，说明脱保护成功。
42.氨基酸偶联反应：称取fmoc-c端第二个氨基酸(带保护)、hobt、dic加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应1h。取少量树脂检测，用茚三酮法检测，若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。若树脂为无色，说明反应完全；待反应完全后，用dmf洗涤树脂四次，然后抽干。向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的fmoc保护基团。脱完保护后用dmf洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。取少量树脂用茚三酮法检测，树脂有颜色，说明脱保护成功。按照步骤依次连接氨基酸。
43.合成肽的切割和分离：用切割试剂将多肽保护基团全部切除，并从树脂上切割下来，纯化。通过hplc将目标肽段与杂质分离，将目标肽段冻干后得到产品通过质谱分析验证了合成物的纯度大于97％。
44.实施例2：多肽对小鼠创面愈合速度和创面愈合质量的影响
45.采用3％戊巴比妥钠1ml/kg静脉麻醉。小鼠背部备皮后,将打孔器调至直径5cm，用甲紫液染色触头。在小鼠背部头侧1/3处,以脊柱为中心分别打印手术标记。用强力碘消毒术区皮肤,铺无菌巾。手术操作完全在无菌条件下，沿印迹统一大小完整切除设计创面的所有皮肤和浅筋膜组织，直到深筋膜面,彻底止血。自制前端带有筛孔的无菌导药管埋于小鼠背部创面无菌纱布下，以方便给药。空白对照给予生理盐水，其他分组小鼠分别给予对应合成多肽(8mg/ml)。切口用无菌纱布包扎。观察创面的愈合情况，于第10天用游标卡尺分别测量未愈合创口的纵径和横径，计算愈合面积。愈合面积＝创口总面积-(长径
×
短径
×
0.785)。
46.结果表明，外涂给药能明显加速皮肤创伤愈合。seq id no:1-4的多肽给药14天后创面大小均明显低于空白对照，9天后病理组织学观察，对照组大鼠皮肤损伤后缺损灶面积较大，有的上皮组织完全缺失，有的被部分上皮组织覆盖,但表皮层较薄，连续性较差。多肽
给药后，表皮层修复较完全，表皮层较厚(表1)。
47.表1：伤口及伤口愈合速度比较表
[0048][0049]
与空白对照相比，*p《0.05，**p《0.01.
[0050]
因此，组织形态学结果表明，seq id no:1-4的多肽均能加速皮肤创伤愈合。
[0051]
实施例3：多肽对小鼠胚胎成纤维细胞nih 3t3细胞增殖的影响
[0052]
将nih 3t3细胞浓度稀释为1
×
104个/ml,吸取180μl细胞悬液接种到96孔板中，放置37℃、5％co2恒温敷箱中培养24h。细胞完全贴壁后加药孔分别加入含200μg/ml，100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml seq id no:1的多肽的10％fbs-dmem培养液20μl。空白对照组为10％fbs-dmem培养液，每组6个复孔。放置37℃、5％co2恒温敷箱中继续培养48h。培养结束后，每孔加入0.5mg/ml mtt溶液20μl，于37℃、5％co2条件下继续孵育4h，弃去培养液，加入二甲基亚砜(dmso)150μl，振荡10min，以酶标仪测定570nm波长下的吸光度。计算细胞增殖率：细胞增殖率＝[a
570nm
(实验组平均)-a
570nm
(空白对照组)]/a
570nm
(空白对照组)。
[0053]
结果表明，seq id no:1的多肽在1-200μg/ml浓度时作用于小鼠胚胎成纤维细胞nih 3t3 24h能显著促进细胞增殖(图2)。
[0054]
实施例4：多肽对nih 3t3细胞迁移的影响
[0055]
小鼠胚胎成纤维细胞nih 3t3细胞培养于含10％fbs、1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基中，各孔分别加入无血清培养基或seq id no:1的多肽(10μg/ml)，放在孵箱继续培养24h。待测细胞培养至对数期，消化细胞，用pbs和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2
×
105/ml；在transwell下室加入500μl含10％fbs的培养基，上室加入100～200μl细胞悬液，培养24h；培养结束后，擦掉上室未迁移细胞；将其下表面浸泡在4％多聚甲醛溶液中，固定20min，用结晶紫染色20min，显微镜下观察细胞拍照，计算pet膜下表面迁移的细胞数(表2)。
[0056]
表2：迁移细胞计数表
[0057][0058][0059]
与空白对照相比，*p《0.05，**p《0.01.
[0060]
结果表明：与空白对照相比，10μg/ml的seq id no:1的多肽能够显著促进nih 3t3
细胞的迁移。