结直肠癌SDC2甲基化检测引物、探针、试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及结直肠癌sdc2甲基化检测引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

1、近几年来，随着人们生活水平提高以及膳食结构的改变，我国结直肠癌的发病率和死亡率已跃居恶性肿瘤的前五位，尤其在城市的发病率位居恶性肿瘤第二位，死亡率第四位。结直肠癌的早期诊断和治疗对于患者的预后和生存起着关键性的作用。得益于基因诊断技术的发展，我国结直肠癌的5年存活率不断地提高达到了57.6％左右，但仍低于欧洲和美国水平(分别为60％和64％)。

2、目前，医院检测结直肠癌的金标准方法为乙状结肠镜检查，但其检测费用高，检测过程对患者伤害大。而市面上出现的许多甲基化分子诊断试剂盒可以克服以上镜检缺点作为早期辅助诊断有效手段。研究证实结直肠癌相关基因sdc2高度甲基化伴随着或早于细胞恶性增生，可以作为非常有效的癌症dna甲基化标记物，其基因的甲基化的检测可用于结直肠癌的预测。

3、甲基化检测过程一般为以重亚硫酸盐处理后dna片段作为模板，特异地设计一对引物用于扩增含待测甲基化位点的小片段dna，同时用一个与待测甲基化位点杂交互补的探针，由于探针5'端含有报告荧光，通过荧光信号进行实时定量。目前的结直肠癌甲基化检测试剂盒大都是采用荧光法作为检测技术，荧光法基于taqman荧光定量pcr技术，是目前最为常见而且最有效率检测基因甲基化的分子诊断手段之一。

4、sdc2甲基化检测位点大多数都集中在启动子cpg岛多个位点：公布号为cn102686744 a的中国发明专利的检测位点位于转录起始位点+681到+1800核苷酸之间；公布号为cn 105543354 a的中国发明专利的检测位点位于起始位点+350到+382核酸之间；公布号为cn 109486955 a的中国发明专利的检测位点位于+250到+800核酸之间。转录起点+250到+800核酸区间因含有大量的cpg岛，为sdc2甲基化检测的热点区域。由这些检测区域开发的结直肠癌的试剂盒都能有效地检测出阳性样本，其敏感度一般在85％～90％之间。

5、sdc2多位点检测方法比较复杂且筛选成本高，引物探针需要严格设计来避免非特异性扩增以及克服高gc pcr扩增条件。sdc2多位点检测区域大多数都位于几个gc位点上，多gc位点扩增往往容易导致pcr扩增失败，其原因为：

6、一、gc含有的氢键比例比at多，pcr扩增过程中需要更多的能量去解开模板dna双链，模板dna不容易解开会导致扩增效率下降；

7、二、经亚硫酸处理后的双链dna变成了单链，单链dna中gc丰富区域往往容易通过自身互补配对形成稳定的发夹环二级结构，导致pcr引物和探针无法结合到模板上，dna聚合酶延伸也受到阻碍，结果常出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。

8、目前sdc2甲基化检测试剂盒一般都采用多位点检测，有的采用联合多个基因多个位点检测来提高其敏感度，有的使用二代测序，检测几百上千个甲基化位点来媲美乙状结肠镜检查敏感度，由此开发的试剂盒往往成本高，不适用于大批量的筛查。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供结直肠癌sdc2甲基化检测引物、探针、试剂盒及方法，该方法具有较高的灵敏度和特异性，该方法以非诊断为目的。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种结直肠癌sdc2甲基化检测的引物和探针，引物为sdc2 cga引物和/或sdc2 cgb引物，探针为sdc2 cga探针和/或sdc2 cgb探针；cga为cg16935295；cgb为cg13096260；

3、所述sdc2 cga引物由seq id no:1～seq id no:3中任意一个引物和seq id no:4～seq id no:6中任意一个引物组成；

4、所述sdc2 cgb引物由seq id no:13～seq id no:15中任意一个引物和seq idno:16～seq id no:18中任意一个引物组成；

5、所述sdc2 cga探针由seq id no:7～seq id no:9中任意一个探针和seq id no:10～seq id no:12中任意一个探针组成；

6、所述sdc2 cgb探针为seq id no:19～seq id no:21中任意一个探针(见表1，带下划线的序列为检测的cg位点)。

7、表1

8、

9、本发明的另一技术方案为：一种结直肠癌sdc2甲基化检测的试剂盒，包括上述引物和探针。

10、本发明的又一技术方案为：一种结直肠癌sdc2甲基化检测的方法，使用上述的结直肠癌sdc2甲基化检测的试剂盒进行荧光pcr检测，评估标准为：

11、内参基因的ct值≤37，甲基化sdc2基因ct值≤38时判断样本为阳性；内参基因的ct值≤37，甲基化sdc2基因fam通道ct值＞38时判定为阴性样本；内参基因ct值＞37或者无ct值时，判定为样本不合格。

12、本发明的有益效果在于：本发明通过实验筛选出来sdc2单一甲基化位点，设计得到探针引物序列。本发明的结直肠癌sdc2甲基化检测的引物和探针，使用单一位点cga或cgb，能有效地避开高gc位点的扩增，避开pcr反应失败等扩增问题，具有设计简单，灵敏度高，特异性好，成本低的特点。

技术特征：

1.一种结直肠癌sdc2甲基化检测的引物和探针，其特征在于，引物为sdc2cga引物和/或sdc2 cgb引物，探针为sdc2 cga探针和/或sdc2 cgb探针；

2.根据权利要求1所述的结直肠癌sdc2甲基化检测的引物和探针，其特征在于，所述探针的3＇端皆标记有mgb淬灭基团，所述seq id no:7～seq idno:9和seq id no:19～seq idno:21的5＇端标记有fam荧光报告基团，所述seq id no:10～seq id no:12的5＇端标记有vic荧光报告基团。

3.根据权利要求1所述的结直肠癌sdc2甲基化检测的引物和探针，其特征在于，所述引物由seq id no:3、seq id no:6、seq id no:14和seq idno:18组成，所述探针由seq idno:8、seq id no:11和seq id no:20组成。

4.一种结直肠癌sdc2甲基化检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物和探针。

5.根据权利要求4所述的结直肠癌sdc2甲基化检测的试剂盒，其特征在于，还包括内参引物和内参探针，所述内参引物由seq id no.22和seq id no.23两个引物组成，所述内参探针为seq id no.24所示探针。

6.根据权利要求4所述的结直肠癌sdc2甲基化检测的试剂盒，其特征在于，还包括2×qpcr master mix、模板dna和depc水。

7.根据权利要求6所述的结直肠癌sdc2甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述模板dna的具体制备方法为：样品提取核酸dna后，再对核酸dna进行甲基化处理，得到模板dna。

8.一种结直肠癌sdc2甲基化检测的方法，其特征在于，使用权利要求4所述的结直肠癌sdc2甲基化检测的试剂盒进行荧光pcr检测，评估标准为：

9.根据权利要求8所述的结直肠癌sdc2甲基化检测的方法，其特征在于，所述荧光pcr检测的反应程序为：95℃预变性5min；95℃15s，55℃10s，45次循环；末端检测fam通道和vic通道。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及结直肠癌SDC2甲基化检测引物、探针、试剂盒及方法。本发明的引物为SDC2cgA引物和/或SDC2cgB引物，探针为SDC2cgA探针和/或SDC2cgB探针。本发明使用单一位点cgA或cgB进行甲基化检测，能有效地避开高GC位点的扩增，避开PCR反应失败等扩增问题，具有设计简单，灵敏度高，特异性好，成本低的特点。

技术研发人员：陈刚
受保护的技术使用者：福建省肿瘤医院（福建省肿瘤研究所、福建省癌症防治中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13