一种基于Cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法及其应用

本发明涉及微生物基因工程和生物，具体涉及一种基于cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法及其应用。

背景技术：

1、少孢节丛孢(arthrobotrys oligospora)是分布最为广泛、研究最为系统深入的捕食线虫真菌。在土壤环境中，少孢节丛孢通常营腐生生活方式。在遭受到线虫诱导的情况下，少孢节丛孢会生成特异化的捕食器官，即三维粘性菌网，捕捉线虫，并随后穿刺线虫体壁，将其消化吸收。捕食器官的形成，是少孢节丛孢转向肉食性生活方式的显著标志。线虫，特别是植物寄生性线虫，在农林业生产中会造成巨大的经济损失，已经成为最严重的农业病害之一。在自然界中，以少孢节丛孢为代表的捕食线虫真菌，正是线虫的天敌之一，为线虫的自然防控发挥了重要作用。因此，对于少孢节丛孢的“变身”机制研究，具有非常重要的科学意义和生产价值。

2、基因编辑技术是研究功能基因组的重要工具，使用该技术研究人员可以在多个物种中实现精准的编辑，即在核苷酸水平进行操作。目前发展起来的3种主要基因编辑技术是：锌指核酸酶技术(zfns)、类转录激活因子核酸酶技术(talens)和crispr/cas技术。从分子生物学角度看来，基因定点修饰操作可以分为敲入、敲除、缺失及基因融合这几种类型。而其中敲除又有多重敲除和条件敲除等特殊类型，本质上均是利用非同源末端连接途径(nhej)修复和同源重组(hr)修复，联合特异性dna的靶向识别及核酸内切酶完成的dna序列改变。虽然talens、zfns和crispr/cas三种技术在技术细节上有着各自独一无二的特色，但它们在各类应用中的基本模式却是相似的，例如在转基因大鼠的构建上，三种技术均是以显微注射的方式进入大鼠胚胎的。

3、在转录激活因子核酸酶技术与锌指核酸酶技术中，这些嵌合核酸酶由两部分组成——一个可编码的序列特异性dna结合模块与一个非特异性的dna切割结构域。通过诱导dna双链断裂(dna double-strand break)来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行的同源定向修复，talens和zfns能够完成一系列遗传学编辑修饰操作。但不论是talens技术还是zfns技术，其定向打靶都依赖于dna序列特异性结合蛋白模块的合成，这一步骤非常繁琐费时。此外，因zfns技术存在高脱靶率及高细胞毒性，talens技术的高成本往往只有大型公司才能开展，这些因素在一定程度上限制了基因编辑的广泛应用。相较于这两种技术，近些年涌现出的crispr/cas技术是以rna导向进行dna识别及编辑，更易于操作，可同时实现对多位点的基因编辑，具有更强的可扩展性。

4、目前，crispr/cas系统已广泛用于小鼠、斑马鱼、线虫、家蚕、果蝇等多种模式生物中。作为重要的生防菌，crispr/cas基因编辑系统并未广泛应用于食线虫真菌，在一定程度上制约其功能基因组的研究。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种基于cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法及其应用，以便进一步利用食线虫真菌诱捕、灭杀线虫。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、一种基于cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法，包括如下步骤：

4、(1)自食线虫真菌的基因中筛选出如seq id no.1所示的外显子，并在该外显子中筛选出序列分别如seq id no.2、seq id no.3所示序列protospacer1、protospacer2；

5、(2)以分别如seq id no.4、seq id no.5所示的引物spcas9-sg1-1f、spcas9-sg1-1r扩增含protospacer1在内的上游序列，以分别如seq id no.6、seq id no.7所示的引物spcas9-sg1-2f、spcas9-sg1-2r扩增含protospacer1在内的下游序列；以限制性内切酶spei和hind iii双酶切cas9载体；将含protospacer1在内的上下游序列连接于双酶切后的cas9载体中；

6、(3)以引物spcas9-sg1-1f和如seq id no.8所示的引物sg2-1r扩增含protospacer2在内的上游序列，以如seq id no.9所示的引物sg2-2f和spcas9-sg1-2r扩增含protospacer2在内的下游序列；以限制性内切酶sac i和sal i双酶切puc19载体；将含protospacer2在内的上下游序列连接于双酶切后的puc19载体中；

7、(4)以分别如seq id no.10、seq id no.11所示的引物ex2donor-f1、ex2donor-r1扩增步骤(1)所述外显子的上游序列，以分别如seq id no.12、seq id no.13所示的引物ex2donor-f2、ex2donor-r2扩增步骤(1)所述外显子的的下游序列；以限制性内切酶sac i和sal i双酶切puc19载体；将含3个点突变在内的外显子2连接于双酶切后的puc19载体中；

8、(5)制备食线虫真菌原生质体，并将步骤(2)～(4)所得载体，利用peg/caci2介导的方法导入食线虫真菌中。

9、更优地，所述食线虫真菌为少孢节丛孢或鞭式节丛孢。

10、所述的基于cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法在利用食线虫真菌制备线虫抓捕器中的应用。

11、综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及益效果：

12、本发明提供了一种基于cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法，经本发明方法进行的基因编辑构建的菌株，可以自发产生捕器，大大提高了线虫抓捕效果。本发明可精确地对三个目的氨基酸进行定点置换，可更精细地编辑少孢节丛孢，为食线虫真菌遗传体系的建立和基因功能研究提供了新思路。

技术特征：

1.一种基于cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的基于cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法，其特征在于，所述食线虫真菌为少孢节丛孢或鞭式节丛孢。

3.如权利要求1所述的基于cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法在利用食线虫真菌制备线虫抓捕器中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于Cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法及其应用，涉及微生物基因工程和生物技术领域。本发明利用食线虫真菌的基因中如SEQ ID NO.1所示的外显子以及该外显子中分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示序列protospacer1、protospacer2，并设计SEQ ID NO.4～11所示的引物，先后构建三个载体并将三个载体引入食线虫真菌中。本发明提供了一种基于Cas9基因的食线虫真菌基因编辑方法，经本发明方法进行的基因编辑构建的菌株，可以自发产生捕器，大大提高了线虫抓捕效果。

技术研发人员：王芯,周亮,何智伟,张克勤,郑喜,康佳磊
受保护的技术使用者：云南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11