基于DIP-DIP的试剂盒及其在混合样本鉴识和祖源推断上的应用

本发明属于分子生物，具体涉及一种基于dip-dip的试剂盒及其在混合样本鉴识和祖源推断上的应用。

背景技术：

1、微量、混合以及降解等疑难检材日益成为法医检案工作的重点与难点问题。

2、实现对疑难检材的有效检测及成功分型，对案件中未知个体的最终甄别与举证具有重要意义，微单倍型是法医遗传学领域新兴的复合遗传标记，高通量测序技术是微单倍型检测分型的金标准，在常规str分型无法获得满意的分型结果时，利用有限的生物检材获得更多人相关的身份信息往往能够为案件提供关键的指向性线索或者证据，且由于高通量测序平台在法医dna实验室尚未得到普及，同为二等位基因遗传标记的插入/缺失(insertion/deletion,dip)多态性逐渐展现出一定应用优势，利用毛细管电泳平台对一定片段长度内(<300bp)两个两个连锁的dip进行分型，其等位基因的表现形式可由扩增子片段的大小进行区分，短片段范围内连锁的dip遗传标记构成的复合dip-dip标记物可类比于微单倍型遗传标记，并且复合dip-dip遗传标记具有与微单倍型类似的诸多优势，如多态性高、具有祖先信息推断潜能，现提出一种用于遗传信息检测的dip-dip复合体系。

技术实现思路

1、为了解决疑难检材分型以及同时实现混合样本鉴识及祖源推断等问题，本发明在基因组范围内系统挑选了一组复合dip-dip遗传标记，通过限定复合dip-dip遗传标记内dip与dip之间的插入/缺失片段大小存在差异，使复合dip-dip遗传标记的每个单倍型等位基因可以通过片段差异区分，进而利用毛细管电泳平台进行分型检测。对每一个复合dip-dip位点设计一对引物，基于五色荧光标记技术实现了对41个复合dip-dip遗传标记和1个性别鉴定基因座amel的有效扩增和检测，而后对设计的复合dip-dip遗传标记进行人群验证，获得其单倍型等位基因频率。

2、本公开的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种dip-dip复合体系，所述复合体系包括扩增以下41个dip-dip位点的引物，针对每个dip-dip位点仅设计一对引物，通过其单倍型等位基因的片段长度差异实现不同等位基因的区分；所述dip-dip位点包括rs375064432-rs35924832、rs200948419-rs35727128、rs35291115-rs77983960、rs57803994-rs149065177、rs11455726-rs139352836、rs149741414-rs58466926、rs57913087-rs34358108、rs145695868-rs10662420、rs144838892-rs200875353、rs138642414-rs35703100、rs375709050-rs79612828、rs35515881-rs10545807、rs141416140-rs56114052、rs11286626-rs3067346、rs10542319-rs201032359、rs11404703-rs145084515、rs3214372-rs3217132、rs137991189-rs11375636、rs71766343-rs56207509、rs35838770-rs11434204、rs11435843-rs71300657、rs113897607-rs34846650、rs35211839-rs74678400、rs3041403-rs143792664、rs35002191-rs56939199、rs147938518-rs10550117、rs35126629-rs71465310、rs144820685-rs67660578、rs59552010-rs61656423、rs199632543-rs72512782、rs5808095-rs5808096、rs377114040-rs3055901、rs141490808-rs147923862、rs35880714-rs145177299、rs3069843-rs34063661、rs570616838-rs148035090、rs4065037-rs371735069、rs11383217-rs3072903、rs72004284-rs139944155、rs150531146-rs200084710、rs71823338-rs149565141；

4、引物具体序列如seq id no.1～83所示。

5、进一步地，所述dip-dip复合体系包括用于检查性别的amel基因座引物，引物具体序列如seq id no.84～86所示。

6、一种基于复合扩增dip-dip遗传标记的检测试剂盒，可在混合样本鉴识和祖源推断应用的基础上，有效进行个体识别和亲缘关系鉴定。所述试剂盒包括pcr反应体系，所述体系包含扩增dip-dip复合体系中41个dna位点的引物，引物具体序列如seq id no.1～83所示。

7、进一步地，所述dip-dip复合体系的特异性扩增引物分为四组，分组情况如下：

8、第一组：seq id no.1～24；

9、第二组：seq id no.25～46；

10、第三组：seq id no.27～64；

11、第四组：seq id no.65～86；

12、采用四种不同颜色的荧光染料对四组复合dip-dip位点进行标记，所述五种不同颜色的荧光染料标记分别为6-fam、joe、tamra、rox和alexa633。

13、进一步地，所述第一组采用蓝色标记为6-fam荧光素分子，第二组采用绿色标记为joe荧光素分子，第三组采用黄色为tamra荧光素分子，第四组采用红色为rox荧光素分子，分子量内标为size-500，采用alexa633(橙色)进行标记。

14、进一步地，所述dip-dip复合体系中还包括含有taq酶、tris-hcl缓冲液、kcl、mgcl2及bsa的master mix，41个复合dip-dip遗传标记的等位基因分型标准物，dna标准品和荧光分子量内标size-500。

15、有益效果：

16、1、本发明提供的检测体系是采用五色荧光标记技术，一次性实现了对常染色体上41个复合dip-dip遗传标记及1个性别鉴定基因amel的稳定、灵敏、特异、高效的复合扩增分析，体系中复合dip-dip遗传标记的检测数量较多，试剂盒的鉴定效能较高；

17、2、本发明选取的41个复合dip-dip遗传标记在具有较高的遗传多态性的同时也体现出祖源推断应用潜能，可应用于法医个体识别、混合样本鉴识、复杂亲缘关系鉴定以及祖源推断等领域；

18、3、本发明选取了常染色体上41个复合dip-dip遗传标记和性别鉴定基因amel，具有极好的兼容性，多态性高，体系中复合dip-dip遗传标记的最大扩增子片段长度小于230bp，在提高整个体系的鉴别效能的同时，也有助于降解检材分型检测；

19、4、本发明选取的常染色体上41个复合dip-dip遗传标记的等位基因频率在东亚群体中分布较平均，且群体间遗传分化系数(f-statistics，fst)较小，在东亚地区多个族群中的累积识别能力及累积非父排除概率均较高，说明本试剂盒在东亚各个族群中均能得到较好的应用；

20、5、本发明的复合扩增检测体系可利用常用毛细管电泳遗传分析仪，复合dip-dip分型体系能够节约试剂消耗，节省人力成本。

21、6、本发明基于毛细管电泳平台实现了对41个dip-dip的复合扩增和有效分型检测，既往的针对连锁dna遗传遗传标记的研究，最多只是实现了对23个遗传标记的检测，本发明同时实现对多个连锁dna遗传标记的同时检测，检测体系整体的效能得到了显著的提升。