用于细胞生长的试剂或组合物的制作方法

本技术涉及生物领域，具体的涉及用于细胞生长的试剂或组合物。

背景技术：

1、胰腺癌恶性程度高，起病隐匿，早期诊断困难。早期胰腺癌以手术为首选治疗方式，但易复发。进展期胰腺癌对放疗不敏感，只能进行以化疗为主的全身综合治疗。吉西他滨是目前标准胰腺癌化疗的一线治疗药物，但治疗效果不能满足临床需求，新型靶向治疗药物是研究热点。迈人21世纪后，肿瘤的治疗业已进入了分子靶向治疗的时代。所谓分子靶向药物就是主要针对肿瘤发生、发展过程中的关键大分子，包括参与肿瘤发生发展过程中的细胞信号传导和其他生物学途径的靶点(参与肿瘤细胞分化、周期调控、凋亡、浸润和转移等过程中，从dna至蛋白、酶水平的任何亚细胞分子)；通过特异性阻断肿瘤细胞的信号转导，来控制其基因表达和改变生物学行为，或是通过强力阻止肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖，积极发挥抗肿瘤作用。因此，一般而言，分子靶向药物的选择性高，广谱有效，不易发生耐药，同时安全性优于细胞毒性化疗药物。

2、随着现代免疫学和分子生物学的迅猛进展，许多分子靶向治疗药物在单独或联合治疗已初步显示出抗胰腺癌作用。这些药物包括调控肿瘤细胞生长的化合物如ftase抑制剂、抗血管形成的基质金属蛋白酶(mmp)抑制剂(如ma‐rimastat)和血管内皮生长因子(vefg)的单克隆抗体、表皮生长因子受体(egfr)的单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂(imc-c225、erlotinib、gefitinib)、ps‐341以及反义rna等，它们单用或联合gem应用可能有效，目前正在成为新的研究热点。现有的分子靶向制剂目前针对胰腺癌治疗的分子靶向制剂主要为抑制表皮生长因子受体(egfr)和抗血管内皮生长因子(vegf)及其受体，egfr靶向制剂主要包括西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)；vegf和vegfr靶向制剂主要包括贝伐单抗(bevacizumab)、单抗dc101、抑制剂zd6474和su5416。但是目前，可提供的治疗药物种类还不够丰富多样。

3、在经典wnt/β-catenin信号中，wnt配体可以和fz受体以及低密度脂蛋白受体相关蛋白6(lrp6)形成蛋白复合体。dvl作为支架蛋白是高度动态的，通过与wnt-fz-lrp6蛋白复合体不断聚合解聚，来调节信号的顺利发生。简单而言，dvl蛋白能否顺利从细胞质结合到细胞膜上，对于wnt/β-catenin信号的顺利发生非常重要。通过多肽文库筛选，dvl蛋白的dep结构域和c端序列(dep-c区域)对于募集该蛋白到fz上起到重要的作用。研究发现小鼠dvl1的dep结构域表面有数个氨基酸残基聚集在一起，使dep结构域表面带正电荷。由于细胞膜内侧面的脂质带负电荷，通过静电吸引作用力，募集dvl蛋白结合到fz蛋白，但是这种相互作用对胞内ph值比较敏感，主要受质膜na+/h+交换子nhe2的影响。

4、depdc1是包含一个dep结构域的癌蛋白，除在睾丸中表达外，在其他正常人体组织中被很难检测到。dep结构域是在dishevelld、egl-10和pleckstrin3种蛋白中被发现的，因而以这3个蛋白质的首字母命名。癌蛋白depdc1的编码基因depdc1位于染色体1p31.2，长约23kb，由于选择性剪切，该基因的表达产物可形成分子量分别为93kd和61kd的两种亚型。由于在除睾丸外的正常组织中尚未发现depdc1表达，因此对depdc1的功能研究大多是癌细胞中进行的。而目前对其作用机制的了解主要来自有关膀胱癌的实验研究，即depdc1与锌指蛋白224(znf224)形成复合物抑制锌指蛋白a20基因表达，减弱了a20对核因子κb抑制蛋白(i-κb)降解的抑制作用，从而促进nf-κb转位进入细胞核内激活相关基因表达，最终发挥抗凋亡生理作用。在癌细胞系hela、mcf7和sh-sy5y的实验表明，depdc1可以调控c-jun氨基末端激酶(jnk)的激活及抗凋亡蛋白髓细胞白血病基因-1的降解，长春新碱就是通过这一途径发挥其诱导细胞凋亡的生理作用。

5、depdc1（depdomaincontaining1）已经被证实与多个肿瘤的发生密切相关，例如前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌。并且在这些肿瘤中高度表达，并且与临床预后不良密切相关。以上的研究均表明，depdc1在大多数肿瘤中过表达，具有成为生物标志物和治疗靶点的潜力。depdc1在肺腺癌中过表达也被初步证实，有研究证实靶向depdc1会激活核因子κb（nf-κb）信号通路介导肺腺癌细胞的凋亡。sirna介导的depdc1缺失显著抑制了鼻咽癌细胞系cne-1和hne-1的增殖，但是目前，针对depdc1敲除在胰腺癌中的应用研究还不多，有待进一步的研究。

技术实现思路

1、本发明一方面，针对depdc1蛋白，开发了特异性的单克隆抗体。

2、进一步的，所述单克隆抗体为ac06。

3、进一步的，所述的单克隆抗体的轻链可变区序列如seq id no：1所示，重链可变区序列如seq id no：2所示。

4、进一步的，本发明的单克隆抗体还可以被修饰。

5、具体的，所述修饰为在氨基酸序列上进行一个或二个或三个或四个或五个或六个或七个或八个的氨基酸的取代，所述取代后，保持单抗的生物活性保持不变。

6、具体的，所述取代包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中“氨基酸取代”或“取代”意指亲本多肽序列中特定位点的氨基酸被另一种氨基酸替换。本文中，术语“保守的修饰”或“保守的序列修饰”意指不显著影响或改变含所述氨基酸序列的抗体结合特性的氨基酸修饰。所述保守的修饰包括氨基酸取代、插入和缺失。修饰可通过本领域公知的标准技术例如定点突变和pcr介导的突变引入本发明的抗体中。保守的氨基酸取代是其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族是本领域已定义的。所述家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链的氨基酸(例如苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的cdr区或框架区中的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基取代并且可测试改变后的抗体(变体抗体)保留的功能。

7、进一步的，本发明的单克隆抗体可以通过小鼠腹水制备，也可以通过杂交瘤细胞培养获得。

8、更进一步的，还可将本发明的编码抗体的核酸整合到载体中，优选表达载体以表达蛋白。多种表达载体可用于表达蛋白。表达载体可包含自我复制的非染色体载体或者整合进入宿主基因组的载体。表达载体的构建应适合宿主细胞类型。因此，可用于本发明的载体优选表达载体包括但不限于可使蛋白在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中表达的载体。本领域已知，多种可用于本发明中以表达抗体的表达载体可通过商购或其他途径获得。

9、进一步的，本发明提供了depdc1单克隆抗体ac06在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。

10、进一步的，所述癌症是选自子宫癌、上消化道鳞状癌、所有其他上消化道癌、甲状腺癌、肉瘤、尿路上皮肾癌、所有其他肾癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、神经内分泌癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、肺腺癌、所有其他肺癌、白血病、肝胆癌、肝胆管癌、头颈癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、乳癌、膀胱癌和肛门直肠癌。

11、在一些实施例中，所述癌症类型是选自肛门癌、膀胱癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肝/胆管癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、浆细胞肿瘤和胃癌。

12、在一些实施例中，所述数个癌症类型是选自甲状腺癌、黑色素瘤、肉瘤、骨髓性肿瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌、尿路上皮癌、子宫颈癌、肛门直肠癌、头颈癌、结肠直肠癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、胆囊癌、上消化道癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和肺癌。

13、更进一步的，所述癌症是对应的depdc1蛋白高表达类型的癌症。

14、进一步的，所述药物组合物还含有第二治疗剂进行组合使用。

15、另一方面，本发明提供了与治疗剂例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)。本文中此类交联物称为“免疫交联物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫交联物称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害(例如可杀死细胞)的任意试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢药(例如，氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、thioepa chlorambucil、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素c和顺-二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(amc))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。可连接到本发明抗体的治疗用细胞毒素的其它实例包括多卡米星、卡奇霉素、美登素和阿里他汀及其衍生物。

16、更进一步的，本发明还提供了depdc1单克隆抗体ac06制备的用于治疗癌症的药物组合物。

17、具体的，药物组合物还含有药学上可接受的载体。

18、本技术所述药物组合物可以肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述注射给药可以包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，例如，可以为固体、半固体或液体的形式，即可以为水溶液、非水溶液或混悬液，还可以为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。例如，所述药物组合物可以被制备为液体。例如，所述药物组合物可以被制备为固体，固体可以被溶解为液体使用。

19、有益效果

20、本发明以depdc1蛋白为靶标制备并获得了特异性针对depdc1的单克隆抗体，该抗体经过检测与多种物质均不发生交叉反应表现出了较好的特异性，同时将该单克隆抗体与癌细胞共培养后发现能够抑制depdc1的表达同时还能够抑制癌细胞的增殖。