1.本发明涉及生物工程技术领域，具体的，涉及小反扭藓配子体的培养基及培养方法。
背景技术：
2.小反扭藓隶属于丛藓科、反扭藓属，植物体密集丛生，可形成“藓毯”，深绿色，生长后期略微发褐绿色，株高约2～3cm，茎单一或束状分枝。叶丛生于茎顶，长披针形，干燥时叶先端往往卷曲为筒状，湿润时展开，叶缘多齿，中肋粗壮在叶尖下消失，叶基部细胞为长矩形。孢蒴直立，圆柱形，具明显的台部，黄绿色，老时呈棕色。蒴柄细，长约1cm，干燥时常扭曲，雌雄同株。是中国特有种，在我国黑龙江、河北、甘肃、云南及西藏等地都广泛分布。
3.小反扭藓在城市分布广泛，易于采集，叶片具有双层细胞，具有良好的抗旱性、抗寒性，可以在野外完成完整的生活史，容易产生孢蒴。同时还具有良好的吸水性和持水性，在吸水和储水材料制造、室外和室内绿化、环境指示、栖息地重建、修复和维持等方面的应用有很大的发展潜力。
4.苔藓植物植株矮小，在生态和经济方面的开发利用较少，因此国内外对苔藓植物组织培养的研究相对较少，内容也多集中在孢子萌发或原丝体发育方面，对苔藓的扩繁及继代培养的研究较少。
5.目前，现有技术中没有关于利用孢蒴在培养瓶内扩繁小反扭藓配子体的相关报道，也未见关于小反扭藓土壤定植的研究报道。
技术实现要素：
6.本发明提出小反扭藓配子体的培养基及培养方法，可以短时间内实现大量小反扭藓配子体的形成和扩繁、土壤定植小反扭藓的配子体。
7.本发明的技术方案如下：
8.小反扭藓配子体的孢子培养基，包括mgso4·
7h2o 200～300mg/l、kh2po
4 200～300mg/l、feso4·
4h2o 10～15mg/l、kno
3 1000～1500mg/l、酒石酸铵900～1000mg/l、cacl2·
2h2o100～150mg/l、葡萄糖4800～5200mg/l。
9.作为进一步的技术方案，包括mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l、feso4·
4h2o12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l。
10.作为进一步的技术方案，所述kh2po4的ph为6.5。
11.小反扭藓配子体的增殖培养基，包括孢子培养基的组分，还包括2,4-d 0.5mg/l、琼脂粉8g/l。
12.小反扭藓配子体的培养方法，包括以下步骤：
13.s1、将小反扭藓的孢子悬浮液，接种至所述的孢子培养基中，进行培养，得到原丝体和配子体；
14.s2、将所述原丝体和配子体接种至所述的增殖培养基中，进行培养，得到新生配子
体；
15.s3、将所述新生配子体接种至定植培养基中，进行培养，得到小反扭藓配子体。
16.作为进一步的技术方案，所述s1、s2、s3中进行培养时，温度25
±
2℃，光照强度2500lx，光照时间16h/天。
17.作为进一步的技术方案，所述s1中孢子悬浮液由以下方法制备：将消毒后的孢蒴破碎，制成孢子悬浮液；
18.所述孢蒴消毒具体为，依次使用水冲洗、体积分数75％的乙醇溶液消毒灭菌5min、水冲洗。
19.作为进一步的技术方案，所述s1中培养时间为30天。
20.作为进一步的技术方案，所述s2中培养时间为40天。
21.作为进一步的技术方案，所述s3中定植培养基为湿润的腐殖土培养基，培养时间为10天。
22.小反扭藓配子体的继代培养方法，包括以下步骤：
23.s1、将小反扭藓的孢子悬浮液，接种至所述的孢子培养基中，进行培养，得到原丝体和配子体；
24.s2、将所述原丝体和配子体打碎，接种至继代培养基中，得到继代的小反扭藓配子体。
25.作为进一步的技术方案，所述继代培养基为孢子培养基或孢子培养基中加入琼脂粉8g/l。
26.本发明的工作原理及有益效果为：
27.1、本发明首次建立了利用孢蒴培养小反扭藓配子体的方法，填补了现有技术的空白；并且使用本发明的培养方法，可以通过人工培养快速获得大量小反扭藓配子体，为园林绿化、屋顶绿化、垂直绿化、室内绿化、吸水材料制作等领域提供丰富材料。
28.2、本发明提供的培养基及培养方法还可以实现小反扭藓的继代培养、扩繁，从而持续提供苔藓材料。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
30.实验组一
31.探究消毒灭菌处理方式的影响，分为八个实施例，分别为实施例1～8(不同之处在于消毒灭菌处理方式的不同)，实验方法如下：
32.将孢蒴先用水冲洗，再进行消毒灭菌处理，最后用水冲洗后，破碎使孢子释放出来，制成孢子悬浮液，接种至孢子培养基中进行培养，在25
±
2℃、光照强度2500lx、光照时间16h/天的恒温光照培养箱中生长；观测孢子萌发率并计算出孢子无污染率。
33.孢子无污染率(％)＝未污染孢子数/总孢子数
×
100％
34.孢子培养基组成：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝
6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、微量元素(cuso4·
5h2o0.055mg/l、h3bo
3 0.614mg/l、cocl2·
6h2o 0.055mg/l、na2moo4·
2h2o 0.025mg/l、znso4·
7h2o0.055mg/l、mncl2·
4h2o 0.389mg/l、ki 28mg/l)cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l。
35.实施例1
36.1％质量分数naclo配制的75％体积分数的乙醇溶液消毒灭菌2min；孢子无污染率20％。
37.实施例2
38.1％质量分数naclo配制的75％体积分数的乙醇溶液消毒灭菌3min；孢子无污染率28％。
39.实施例3
40.1％质量分数naclo配制的75％体积分数的乙醇溶液消毒灭菌4min；孢子无污染率56％。
41.实施例4
42.1％质量分数naclo配制的75％体积分数的乙醇溶液消毒灭菌5min；孢子无污染率72％。
43.实施例5
44.75％体积分数乙醇溶液消毒灭菌2min；孢子无污染率83％。
45.实施例6
46.75％体积分数乙醇溶液消毒灭菌3min；孢子无污染率85％。
47.实施例7
48.75％体积分数乙醇溶液消毒灭菌4min；孢子无污染率92％。
49.实施例8
50.75％体积分数乙醇溶液消毒灭菌5min；孢子无污染率98％。
51.由实施例1～8可以看出，使用75％体积分数乙醇溶液消毒灭菌5min，小反扭藓孢蒴的无污染率最高，可达到98％。
52.实验组二
53.探究孢子培养基的影响，分为三个实施例，分别为实施例9～11(不同之处在于孢子培养基的组成)，实验方法如下：
54.将孢蒴先用水冲洗，再使用75％体积分数乙醇溶液消毒灭菌5min，最后用水冲洗后，破碎使孢子释放出来，制成孢子悬浮液，接种至孢子培养基中进行培养；培养条件为：温度25
±
2℃、光照强度2500lx、光照时间16h/天，定期对其生长发育情况进行观测。
55.实施例9
56.孢子培养基组成：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l。
57.实施例10
58.孢子培养基组成：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、微量元素(cuso4·
5h2o0.055mg/l、h3bo
3 0.614mg/l、cocl2·
6h2o 0.055mg/l、na2moo4·
2h2o 0.025mg/l、znso4·
7h2o0.055mg/l、mncl2·
4h2o 0.389mg/l、ki 28mg/l)cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l。
59.实施例11
60.孢子培养基组成：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、微量元素(cuso4·
5h2o 0.055mg/l、h3bo30.614mg/l、cocl2·
6h2o 0.055mg/l、na2moo4·
2h2o 0.025mg/l、znso4·
7h2o 0.055mg/l、mncl2·
4h2o 0.389mg/l、ki 28mg/l)cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l。
61.分别将实施例9～11在相应的孢子培养基中培养30天，观察生长发育情况如下：
62.孢子放入培养基均在3天左右部分孢子萌发，10天左右达到多级萌发，实施例11的培养基萌发极向显著多于实施例9～10。
63.孢子萌发后原丝体伸长分支，培养14天至形成配子体期间，实施例9的培养基中生长的原丝体总长明显超过实施例10～11，21天后实施例9的培养基中生长的原丝体总长达到了实施例10～11的两倍以上。此外，实施例9的培养基配子体发育时间较实施例10～11提前2天，且培养基的原丝体分支数明显多于实施例10～11。
64.因此，实施例10的培养基中配子体生长速率和生物量均低于实施例9；实施例11的培养基影响了小反扭藓生长，配子体的产生数量不如实施例9～10。实施例9的培养基中不添加微量元素反而有利于小反扭藓原丝体的生长，而且能促进原丝体发育为配子体。
65.实验组三
66.探究增殖培养基的影响，分为十个实施例，分别为实施例12～21(不同之处在于增殖培养基的组成)，实验方法如下：
67.s1、将孢蒴先用水冲洗，再使用75％体积分数乙醇溶液消毒灭菌5min，最后用水冲洗后，破碎使孢子释放出来，制成孢子悬浮液，接种至孢子培养基中培养30天；培养条件为：温度25
±
2℃、光照强度2500lx、光照时间16h/天；
68.孢子培养基组成：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l；
69.s2、将s1培养后得到的原丝体和配子体接种至增殖培养基中，进行培养；培养条件为：温度25
±
2℃、光照强度2500lx、光照时间16h/天，定期对其生长发育情况进行观测。
70.实施例12
71.增殖培养基组成：孢子培养基+8g/l琼脂粉。
72.实施例13
73.增殖培养基组成：孢子培养基+0.01mg/l naa+8g/l琼脂粉。
74.实施例14
75.增殖培养基组成：孢子培养基+0.1mg/l naa+8g/l琼脂粉。
76.实施例15
77.增殖培养基组成：孢子培养基+0.5mg/l naa+8g/l琼脂粉。
78.实施例16
79.增殖培养基组成：孢子培养基+0.01mg/l 6-ba+8g/l琼脂粉。
80.实施例17
81.增殖培养基组成：孢子培养基+0.1mg/l 6-ba+8g/l琼脂粉。
82.实施例18
83.增殖培养基组成：孢子培养基+0.5mg/l 6-ba+8g/l琼脂粉。
84.实施例19
85.增殖培养基组成：孢子培养基+0.01mg/l 2,4-d+8g/l琼脂粉。
86.实施例20
87.增殖培养基组成：孢子培养基+0.1mg/l 2,4-d+8g/l琼脂粉。
88.实施例21
89.增殖培养基组成：孢子培养基+0.5mg/l 2,4-d+8g/l琼脂粉。
90.分别将实施例12～21在相应的增殖培养基中培养40天，观察生长发育情况如下：
91.实施例12的培养基中观察到有配子体芽的产生，原丝体和配子体呈绿色；实施例13的培养基中配子体显著发育不良，配子体和原丝体生长状态不如实施例12；实施例14～15的培养基中配子体和原丝体生长状态不如实施例13，且有大量褐色丝状体和极少部分绿色绿丝体，但明显促进了假根的生成；实施例16的培养基中生长状态良好，衍生配子体面积显著优于实施例12；实施例17～18的培养基对小反扭藓配子体衍生存在抑制作用，但抑制作用远小于实施例13～15，有少量褐色丝状体和部分绿色绿丝体；实施例19～20的培养基中配子体生长状态良好，配子体衍生面积也较实施例12显著，但其鲜重水平远不及实施例12；实施例21的培养基中鲜重显著超越了实施例12，且配子体衍生面积与实施例12无差，在配子体上有新生的配子体小芽的分化形成。
92.因此，可以看出，在孢子培养基中加入不同浓度的激素处理液，对诱导配子体形成新生配子体植株有不同程度的影响。添加naa的生长状态最差，随着naa浓度的增大对小反扭藓扩繁培养的抑制作用也会更强。在小反扭藓增殖扩繁培养过程中，可以通过施加0.5mg/l2,4-d来促进其衍生配子体及生物量的增加。
93.实施例22
94.s1、将孢蒴先用水冲洗，再使用75％体积分数乙醇溶液消毒灭菌5min，最后用水冲洗后，破碎使孢子释放出来，制成孢子悬浮液，接种至孢子培养基中培养30天；培养条件为：温度25
±
2℃、光照强度2500lx、光照时间16h/天；
95.孢子培养基组成：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l；
96.s2、将s1培养后得到的原丝体和配子体接种至增殖培养基中培养40天；培养条件为：温度25
±
2℃、光照强度2500lx、光照时间16h/天；
97.增殖培养基组成为：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l、2,4-d 0.5mg/l、琼脂粉8g/l；
98.s3、将s2得到的新生配子体接种至湿润的腐殖土培养基中，进行培养；培养条件为：温度25
±
2℃、光照强度2500lx、光照时间16h/天，对其生长发育情况进行观测。
99.培养结果如下：
100.起初黄绿色的配子体在腐殖土培养基中生长17天后颜色逐渐变绿；在腐殖土培养基中生长52天的小反扭藓，仍旧可以继续分支衍生新的配子体；在腐殖土培养基中生长70天的小反扭藓，不再产生新的配子体分支，但还未出现黄化现象。
101.由上述结果可以看出，增殖培养后生长状态良好的小反扭藓配子体可以放入腐殖土中继续生长，以此来保持小反扭藓材料的持续扩繁生长。
102.实验组四
103.探究小反扭藓进行继代培养时，继代培养基的影响，分为两个实施例，实施例23～24(不同之处在于继代培养基中有无添加琼脂粉)，实验方法如下：
104.s1、与实施例22的s1相同；
105.s2、将s1培养后得到的原丝体和配子体研磨后，接种至继代培养基中，进行培养，每隔30天进行一次继代；培养条件为：温度25
±
2℃、光照强度2500lx、光照时间16h/天；定期对其生长发育情况进行观测。
106.实施例23
107.继代培养基组成为：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l。
108.实施例24
109.继代培养基组成为：mgso4·
7h2o 250mg/l、kh2po
4 250mg/l(母液用koh调节ph＝6.5)、feso4·
4h2o 12.5mg/l、kno
3 1010mg/l、酒石酸铵921mg/l、cacl2·
2h2o 147mg/l、葡萄糖5000mg/l、琼脂粉8g/l。
110.培养结果如下：
111.在实施例23～24的培养基中连续进行了3次继代操作，在操作培养30天内均可以明显观察到小反扭藓生物量明显增多。此外，在实施例24的培养基中由配子体衍生的原丝体会不断伸长，在衍生原丝体上会观察到明显的芽体，衍生芽体少部分可以形成配子体；大多数衍生芽体会持续保持此生长阶段，不会形成茎叶体；有些衍生原丝体伸长至空气中，我们称之为气生衍生原丝体，此类原丝体的整体颜色偏白，叶绿素含量低。
112.由上述结果可以看出，将经过孢子培养基培养30天左右的小反扭藓原丝体和配子体，经过研磨接种至固液继代培养基中，在120天中，都可以获得新的大量的配子体，用于扩繁或保种。
113.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。