基因工程改造的鼠巨细胞病毒衍生的工具病毒，及其制备方法和应用

1.本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及基因工程改造的鼠巨细胞病毒(mcmv)衍生的工具病毒，及其制备方法和应用。


背景技术：

2.巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)属于疱疹病毒β亚科。人巨细胞病毒(hcmv)的全球感率为60-100％(manicklal 2013)；我国成人感染率为93.7％(wen 2018)。造血干细胞/骨髓移植后，hcmv活动性感染率高达70％(han 2007)，死亡率高达30％(arizaheredia 2014；focosi 2009)。hcmv可垂直传播至胎儿，导致先天性感染。在欧美发达国家先天性感染率为0.6-0.7％(swanson 2013)，在发展中国家为1-5％(manicklal 2013)。先天性hcmv感染造成的听力损伤在发达国家占总听力损伤的15％，在发展中国家占比则高达33％(dollard 2007)。先天性hcmv感染严重影响了出生人口素质，给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。hcmv尚无有效疫苗；针对hcmv复制的抗病毒药物易产生耐药，刚上市的莱特莫韦(letermovir)已有耐药，且药物的细胞毒性对新生儿及器官和细胞的移植受者有较严重的副作用。因此，寻找新的hcmv感染的干预靶点，对临床干预具有重要的科学意义和临床价值。此外，尚无疫苗干预hcmv感染和相关疾病，疫苗评估体系对疫苗的研发不可或缺。
3.在细胞感染模型中无法开展先天性巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)感染对胎脑发育、听力等神经功能影响的研究、药物评价和疫苗评估；而且cmv感染的严格种属特异性导致hcmv无法感染小鼠。
4.作为cmv研究的模型，鼠巨细胞病毒(mcmv)感染小鼠，广泛用于巨细胞病毒(cmv)的体内研究。为了示踪病毒感染，mcmv通过基因工程改造，在其基因组中插入荧光素酶基因或egfp基因，使其成为工具病毒；用于标记感染的细胞；用于活体成像，示踪病毒感染进程，实现病毒感染进程可视化；便于药物筛选、疫苗或中和抗体的体内评估、药物配伍治疗方案的优化等。
5.redwood等人公开了作为疫苗载体的mcmv-k181 perth株细菌人工染色体(bac)克隆的构建(redwood 2005)。感染期间，在含有gfp编码序列的bac盒存在时，gfp在感染细胞内表达。他们的数据表明，orfs m07至m12对于mcmv-k181毒株的体外复制并不重要(第3002页，右栏，第4-6行)，但去除这些orf和保留bac盒会减弱缺失突变病毒vark14在体内生长(第3005页，右列，第11-13行)。此外，疫苗载体并非用于mcmv感染的示踪和可视化。
6.farrel等人公开了用于实时成像的mcmv-luc，其中hcmv ie1启动子驱动的荧光素酶表达盒被插入到细菌人工染色体(bac)克隆的mcmv smith株基因组的m157中，该基因组被修复后表达mck2(farrel 2015)。farrel等人还公开了用于感染细胞荧光标记的mcmv-gr，其中hcmv ie1启动子驱动的表达盒通过同源重组插入mcmv-k181毒株的m157中，该表达盒在核靶向的tdtomoto的上游编码一个增强绿色荧光蛋白(egfp)编码序列(farrel 2015)。显然，farrel等人结果提示：为了确保其表达，荧光素酶和egfp基因各自分别插入
mcmv的基因组，并且每个基因都直接由hcmv ie1启动子驱动。
7.farrel等人披露了使用猪teschovirus-1 2a肽生成荧光素酶标记的mcmv用于实时成像，其中荧光素酶基因被插入早期裂解基因mcmv m78的下游(命名为m78-luc)(farrel 2016)。很明显，荧光素酶的表达受m78基因的表达控制，即荧光素酶的强度受到m78基因表达水平的限制。
8.本发明的发明人在实践中发现，现有的mcmv-egfp虽然带有绿色荧光标记，但是其绿色荧光较弱，无法达到活体内实时示踪病毒感染进程的要求，而且在传代增殖第2代就已经检测到报告基因丢失的病毒存在的情况。另外，mcmv-luc中，荧光素的表达水平和/或荧光强度也限制了它们在实时成像中的应用。
9.为了便于监测在mcmv感染期间mcmv在小鼠体内的时空分布以及更好的评估mcmv的中和抗体、疫苗以及其他潜在药物的体内效果，有必要开发更好的mcmv的工具病毒用于示踪病毒感染。


技术实现要素：

10.本发明提供了一种基因工程改造的mcmv-k181毒株衍生的工具病毒，所述工具病毒可用于示踪病毒感染。
11.在一些实施例中，所述工具病毒是一个重组的mcmv-k181毒株，包括一个示踪因子表达盒，一个bac骨架，其中所述bac骨架和示踪因子表达盒一起插入到mcmv-k181毒株基因组的m06开放阅读框和m07开放阅读框之间；所述示踪因子表达盒包括三个示踪因子编码序列，从5’到3’依次为第一荧光蛋白、第一连接子、第二荧光蛋白、第二连接子、荧光素酶、polya，转录成一个转录子，在翻译后，形成三个示踪因子，即依次为第一荧光蛋白、第二荧光蛋白、荧光素酶。
12.在一些实施例中，所述bac骨架包括dna复制起点ori，repe基因、sopa基因、sopb基因、sopc基因、ori2复制子、原核生物转录终止子以及氨苄抗性基因。
13.在一些实施例中，所述bac和示踪因子表达盒在mcmv-k181毒株基因组的m06开放阅读框和m07开放阅读框之间的插入位点是6522和6545之间。
14.在一些实施例中，所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白选自gfp(green fluorescent protein)、egfp(enhanced green fluorescent protein)、mgfp(membrane bound form of egfp)、sfgfp(superfolder green fluorescent protein)、mneongreen、staygold、eyfp(enhanced yellow fluorescent protein)、ecfp(enhanced cyan fluorescent protein)、ebfp2(enhanced blue fluorescent protein 2)、tdtomato、mrfp(monomer red fluorescent protein)、mrb3、mscarlt、dsred,mcherry、ypet、mko、mkate和irfp中的任何一种或两种。
15.在一些实施例中，所述第一荧光蛋白是egfp，其氨基酸序列为seq id no.2所示；所述第二荧光蛋白是zsgreen1，其氨基酸序列为seq id no.4所示。
16.在一些实施例中，所述荧光素酶是nanoluc，其氨基酸序列为seq id no.6所示。
17.在一些实施例中，所述第一连接子和第二连接子编码一个连接子多肽，其中该连接子多肽包含至少相邻的甘氨酸和脯氨酸。
18.在一些实施例中，所述连接子多肽是t2a，其氨基酸序列为seq id no.8所示，或是
p2a，其氨基酸序列为seq id no.10所示。
19.在一些实施例中，所述polya是sv40pa，其核苷酸序列为seq id no.11所示。
20.在一些实施例中，所述示踪因子表达盒还包含一个启动子，选自cmv promoter、ef1a promoter、sv40 promoter、pgk1 promoter、ubc promoter、human beta actin promoter、cag promoter、hif alpha promoter。
21.通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。
附图说明
22.本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。
23.图1为mcmv-k181-egfp(k181-egfp)的结构示意图(redwood 2005)。
24.图2为示踪因子表达盒缺失sv40 polya元件的mcmv-k181-v1(k181-v1)的结构示意图。
25.图3为示踪因子表达盒包含sv40 polya元件的mcmv-k181-egfp-nluc-zsgreen1(k181-nluc/green)的结构示意图。
26.图4为pcr结果的电泳图。
27.图5显示k181-egfp、k181-v1和k181-nluc/green重组病毒感染nih3t3细胞的荧光强度。
28.图6显示k181-egfp和k181-nluc/green重组病毒感染nih3t3细胞后蛋白表达的蛋白免疫印迹结果。
29.图7显示k181-egfp和k181-nluc/green重组病毒在nih3t3细胞中的生长曲线。
30.图8显示k181-egfp和k181-nluc/green重组病毒以moi为0.01感染nih3t3细胞，感染后每24小时在相同条件下观察绿色荧光信号。
31.图9显示k181-nluc/green重组病毒在nih3t3细胞中nanoluc报告基因的活性。
32.图10是一个曲线图，显示k181-nluc/green重组病毒感染nih3t3细胞后上清中病毒的滴度与nanoluc报告基因的活性的关系。
33.图11显示k181-nluc/green重组病毒感染icr小鼠具体流程图。
34.图12显示icr小鼠在感染k181-nluc/green重组病毒后的对照组(pbs)和更昔洛韦(gcv)治疗组的活体成像图(每组展示一只代表性结果)。
35.图13显示pbs和gcv组的荧光值的定量分析结果。
36.图14和图15分别显示icr鼠安慰剂组(dmso)和更昔洛韦治疗组(gcv)在感染k181-nluc/green重组病毒感染7天后各个器官的绿色荧光和nluc信号。
具体实施方式
37.可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。
38.在本技术中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用、并入本技术。
39.除非另有说明，在本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细
胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技术之内。这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版(sambrook和russel，2001年)；现代分子生物学实验指南(fm ausubel等主编，1987年，包括补充至2001年)。
40.小鼠巨细胞病毒(mcmv)k181毒株的基因组(genbank：am886412.1)，全长约230kb，编码基因从m01至m170，共计超过170个开放阅读框。
41.为了开发mcmv-k181毒株衍生的工具病毒用于示踪病毒感染，本发明的发明人进行了细致和广泛的研究，包括示踪因子的选择，示踪因子的插入位点，以及示踪因子的表达框的构建。
42.本发明公开了一种基因工程改造的mcmv-k181毒株衍生的工具病毒用于示踪病毒感染；所述工具病毒是一个重组的mcmv-k181毒株，包括一个示踪因子的表达盒，一个bac骨架，bac骨架和示踪因子表达盒一起插入到mcmv-k181毒株基因组的m06开放阅读框和m07开放阅读框之间。所述示踪因子表达盒包括三个示踪因子编码序列，从5’到3’依次为第一荧光蛋白、第一连接子、第二荧光蛋白、第二连接子、荧光素酶、polya，转录成一个转录子，在翻译后，形成三个示踪因子，即依次为第一荧光蛋白、第二荧光蛋白、荧光素酶。所述工具病毒有效提高了示踪的荧光强度及灵敏性，通过活体成像可以直接对mcmv感染起始和播散所至部位/器官的病毒复制水平实现非侵入式观察，从而更精确且全面的评估mcmv在小鼠体内的实时分布与感染水平。
43.在一些实施例中，所述bac骨架包括dna复制起点ori，repe基因、sopa基因、sopb基因、sopc基因、ori2复制子、原核生物转录终止子以及氨苄抗性基因。在一些实施例中，bac骨架和示踪因子表达盒在mcmv-k181毒株基因组中的插入位点位于m06开放阅读框和m07开放阅读框之间，只要不影响m06和m07开放阅读框的功能。在一些实施例中，bac骨架和示踪因子表达盒在mcmv-k181毒株基因组中的插入位点位于6522和6545之间。
44.在一些实施例中，所述第一和第二荧光蛋白可以是目前和未来可用的任何荧光蛋白。荧光蛋白可以是野生型或其变体，只要其荧光强度没有减弱。适用的荧光蛋白包括gfp(green fluorescent protein),egfp(enhanced green fluorescent protein),mgfp(membrane bound form of egfp),sfgfp(superfolder green fluorescent protein),mneongreen,staygold,eyfp(enhanced yellow fluorescent protein),ecfp(enhanced cyan fluorescent protein),ebfp2(enhanced blue fluorescent protein 2),tdtomato,mrfp(monomer red fluorescent protein),mrb3,mscarlt,dsred,mcherry,ypet,mko,mkate,irfp等。在一些实施例中，所述第一和第二荧光蛋白是相同的荧光蛋白。在一些实施例中，所述第一和第二荧光蛋白是不相同的荧光蛋白。在一些实施例中，所述第一荧光蛋白是egfp，其编码核苷酸序列为seq id no.1所示，其氨基酸序列为seq id no.2所示；所述第二荧光蛋白是zsgreen1，其编码核苷酸序列为seq id no.3所示，其氨基酸序列为seq id no.4所示。
45.荧光素酶(luciferase)是自然界中能够产生生物发光的酶的统称。基于荧光素酶的生物发光不需要激发光，特异性强，被组织吸收少，动物体内无自发光，具有背景低、信噪比高的优点；通过活体成像系统，可以采用非侵入式方法，在动物活体状态下进行观察。通过比较萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)，海肾荧光素酶(renilla luciferase)和nanoluc荧光素酶，本发明的发明人发现nanoluc荧光素酶插入mcmv-k181毒株基因组后，不
影响病毒在体内外的复制与传播，并且具有更加出色的灵敏度，便于定量检测。在一些实施例中，所述荧光素酶是nanoluc，其编码核苷酸序列为seq id no.5所示，其氨基酸序列为seq id no.6所示。
46.在一些实施例中，所述第一连接子和第二连接子编码一个连接子多肽，其中该连接子多肽包含至少两个相邻的氨基酸，在它们之间形成肽键的几率非常低。因此，在翻译后，形成单独的示踪因子。在一些实施例中，所述至少两个相邻的氨基酸是甘氨酸和脯氨酸。在一些实施例中，连接子多肽是t2a，其编码核苷酸序列为seq id no.7所示，其氨基酸序列为seq id no.8所示。在一些实施例中，连接子多肽是p2a，其编码核苷酸序列为seq id no.9所示，其氨基酸序列为seq id no.10所示。在一些实施例中，它们的变体可以用；“变体”的定义为一个多肽与一个由序列号代表的氨基酸序列有至少90％，优选95％，更优选98％，甚至更优选99％的同一性，只要变体中的变化不影响其功能。
47.在一些实施例中，所述polya是sv40pa，其核苷酸序列为seq id no.11所示。
48.在一些实施例中，所述示踪因子表达盒还包含一个来源于病毒或哺乳动物的真核启动子，如cmv promoter、ef1a promoter、sv40 promoter、pgk1 promoter、ubc promoter、human beta actin promoter、cag promoter、hif alpha promoter等等。在一些实施例中，所述示踪因子表达盒包含的启动子是cmv promoter。
49.提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们决不旨在限制或缩小本发明的范围，本发明可以快速筛查，以达到降低分析成本、提高检验效率的目的。
50.实施例1、细胞和细胞培养
51.nih3t3细胞(atcc#crl-1658)从atcc获得，保存于我们实验室，并经检测无支原体污染。细胞用含有10％胎牛血清(fbs，gibco/life technologies)和青霉素(100u/ml)-链霉素(100μg/ml)的dulbecco改良eagle培养基(dmem，gibco/life technologies)中培养，培养基每2天更换一次。细胞在37℃含5％二氧化碳的增湿大气中培养。
52.实施例2、统计分析
53.每个实验一式三份，结果来自至少三次独立细胞实验或动物实验，以平均数
±
sd(标准偏差)表示。数据分析采用适当的统计检验，包括student's t检验分析，当p《0.05时，差异显著。
54.实施例3、模板质粒
55.phage-cmv-mcs-ires-zsgreen1质粒由本实验室保存；pegfp-n1(cat.#637402,takara)；pnl1.1质粒(nanoluc)vector(cat.#pan1001，promega)。
56.实施例4、主要试剂
57.primestar max dnapolymerase(cat.#r045b，日本takara公司)；琼脂糖(西班牙biowest公司)；lipofectmax(cat.#fp310，美国abp biosciences公司)；胶回收试剂盒(cat.#d2500-03，美国omega bio-tek公司)。
58.实施例5、构建和扩增重组病毒：mcmv-ampr-sv40(ploya)-nanoluc-p2a-zsgreen1-t2a-egfp(即k181-nluc/green)
59.k181-nluc/green改造自mcmv-k181-egfp(k181-egfp，图1)(redwood2005)。图2显示含有示踪因子表达框缺失sv40 polya元件的mcmv-k181-v1(k181-v1)的结构示意图。图3显示含有示踪因子表达框包含sv40 polya元件的k181-nluc/green的结构示意图。
60.(1)表达框的构建
61.通过pcr分四段扩增，通过融合pcr构建ampr-sv40(polya)-nanoluc-p2a-zsgreen1-t2a表达框。具体操作如下：
62.以pegfp-n1质粒为模板，以f-ampr-sv40pa(seq id no.12)和r-nluc-svpa(seq id no.13)为引物，pcr扩增得到片段a(276bp)；以phage-cmv-mcs-ires-zsgreen1质粒模板，以f-ampr(seq id no.14)和r-ampr-sv40pa(seq id no.15)为引物，pcr扩增得到片段b(1038bp)；以pnl1.1质粒为模板，以f-nluc-sv40pa(seq id no.16)和r-p2a-nluc(seq id no.17)为引物，pcr扩增得到片段c(578bp)；以phage-cmv-mcs-ires-zsgreen1质粒模板，以f-p2a-zg(seq id no.18)和r-t2a-zg(seq id no.19)为引物，pcr扩增得到片段d(784bp)。
63.以f-ampr(seq id no.14)和r-nluc-sv40pa(seq id no.1213)为引物，以片段a和片段b为模板进行融合pcr扩增，得到片段ab(1218bp)；以f-nluc-sv40pa(seq id no.16)和r-t2a-zg(seq id no.19)为引物，以片段c和片段d为模板进行融合pcr扩增，得到片段cd(1340bp)；再以f-hr(seq id no.20)和r-hr seq id no.21为引物，以片段ab和片段cd为模板进行熔合pcr扩增，获得片段abcd(2614bp)，即带有同源臂的left-arm-ampr-sv40(polya)-nanoluc-p2a-zsgreen1-t2a-right-arm表达框。
64.pcr的反应体系(primestar max dna polymerase，日本takara公司)总体积为20μl，pcr体系如下：
[0065][0066]
pcr扩增的条件为：95℃预变性1min；98℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸10s/kb，共34个循环；最后72℃后延伸5min。每轮扩增结束后，将pcr产物进行1％琼脂糖(西班牙biowest公司)凝胶电泳，纯化步骤完全按照试剂盒(美国omega公司)说明书，最后用预热的去离子水来洗脱dna。扩增中所使用的引物详见表1，pcr扩增的电泳结果见图4。
[0067]
表1、pcr扩增引物序列表
[0068][0069]
(2)活化含有k181-egfp的大肠杆菌
[0070]
(a)将含有k181-egfp的e.coli dy380在含有氯霉素抗性的lb固体平板上划线，32℃过夜培养；
[0071]
(b)将单克隆接种于5ml含有氯霉素抗性的lb培养基中，32℃摇床培养过夜；
[0072]
(c)将400μl活化的菌液转移至40ml液体培养基中，32℃摇床培养约3小时，使菌液od600值在0.55-0.6左右；
[0073]
(d)42℃水浴15分钟，活化温度敏感性重组酶；
[0074]
(e)将菌液迅速置于冰上10分钟；
[0075]
(f)4000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；
[0076]
(g)用灭菌超纯水重悬细菌沉淀，4000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；
[0077]
(h)用含有10﹪的甘油重悬细菌沉淀，4000rpm，4℃，10分钟，离心去上清；
[0078]
(i)重复步骤(h)操作一次。
[0079]
(j)80μl含有10﹪的甘油的纯净水重悬细菌沉淀。
[0080]
(3)电转化ampr-sv40(polya)-nanoluc-p2a-zsgreen1-t2a表达框和同源重组得到k181-nluc/green。
[0081]
将300ng的表达框dna(约10μl)加入步骤(2)制备的含有k181-egfp基因组的活化大肠杆菌中，混匀后加入电转杯中并置于冰上；电击条件为：1.6/1.8kv，25uf，200ω,1mm；电击完成后向点转杯中加入无抗性lb培养基并将菌液迅速转移至1.5ml的ep管，在32℃摇床中培养1-2小时；随后2000rpm离心5min，弃上清，将细菌用30μl无菌水重悬后均匀的涂布在固体lb平板(含有氨苄青霉素抗性)，32℃培养36-48h；挑取单克隆进行pcr验证。
[0082]
(4)拯救k181-nluc/green病毒
[0083]
将鉴定正确的含有k181-nluc/green单克隆细菌接种于200ml lb培养基(含有氨苄青霉素抗性)，32℃摇床培养过夜，然后用质粒中抽试剂盒(cat.#740410.50，购自德国mn公司)提取k181-nluc/green-bac基因组，按照说明书操作，最后用100μl预热的灭菌去离子水溶解。
[0084]
转染前一天按4
×
105细胞/孔的密度将nih3t3细胞传代至6孔板(美国corning公司)，使细胞在转染时的融合度达到60-80％。将上述提取的k181-nluc/green-bac基因组转染nih3t3细胞。转染混合液的制备如下：将3μg环状k181-nluc/green-bac dna和无血清和抗生素的dmem培养基配成125μl混合液a；同时将5μl lipofectmax试剂和无血清和抗生素的dmem培养基配成125μl混合液b；室温放置5分钟后，将混合液a与混合液b混合后用移液器吹打混匀得到混合液c，继续室温放置20分钟。随后去掉细胞培养基，用预热的pbs洗一遍细胞，更换为无血清和抗生素的dmem培养基，然后加入转染混合液c，置于37℃细胞培养箱培养。2-3小时后，吸去转染混合液，加入dmem完全培养基；k181-nluc/green感染性单克隆转染后48小时后可以观察到明显细胞病变与绿色荧光，说明我们的感染性单克隆的拯救是成功的，如图5所示。然后继续培养直到细胞全部病变后，收集细胞培养液，即获得k181-nluc/green重组病毒，分装后于-80℃冻存。对比三种重组病毒可以发现，k181-nluc/green重组病毒的荧光明显强于原始的k181-egfp与缺少sv40polya 元件的k181-v1(图5)。
[0085]
(5)检测重组病毒的蛋白表达
[0086]
nih3t3细胞种在100mm培养皿中(美国corning公司)后，在37℃，5％co2条件下培养，待细胞贴壁后，分别用重组病毒mcmv-k181-egfp和mcmv-k181-nluc/green以moi＝1感染细胞。在37℃、5％co2培养箱中吸附2小时后，更换培养皿中的病毒接种液为新鲜的dmem完全培养基。感染24小时后，用细胞刮子刮取感染后的细胞。4℃，1000rmp离心5分钟收集细胞。用预冷的pbs洗涤细胞一遍，再离心去掉上清液，将细胞温和地转移至预冷的离心管中。向细胞沉淀中加入50μl含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(cat.#p0013，中国碧云天公司)，利用超声破碎仪破碎细胞(25％功率，运行3秒，暂停3秒，共超声18秒，重复3次)，接着用barford法测定蛋白含量，加入5
×
上样缓冲液(0.25mol/l ph6.8 tris-hcl，0.5mol/l二硫叔糖醇，10％sds，0.5％溴酚蓝，50％甘油)，按照30μg总蛋白量上样，进行sds-聚丙稀酰胺凝胶(page)电泳(美国bio-red公司)。电泳完成后进行转膜反应，先用甲醇处理聚偏二氟乙烯(pvdf)膜2分钟，然后用去离子水清洗一遍后浸泡于转膜缓冲液中，开始转膜。转膜条件
为冰浴中恒流200ma,120分钟(美国bio-red公司)。转膜完毕后，即刻用tbst液洗膜3分钟，再用含有5％脱脂牛奶的tbst封闭1小时。接着用还有1％吐温-20的tbst洗膜3次后，分别孵育mie1鼠单克隆抗体(美国哈佛医学院的唐七义教授惠赠)，和pm112-113兔多克隆抗体(本实验室委托中国普健生物公司生产)，gfp兔多克隆抗体(cat.#50430-2-ap，美国proteintech公司)，zsgreen1鼠单克隆抗体(cat.#d199984，中国生物工程公司)，nanoluc鼠单克隆抗体(cat.#n7000，美国promega公司)，gapdh兔多克隆抗体(cat.#10494-1-ap，美国proteintech公司)。洗膜后孵育二抗后并再次洗膜。最后进行化学发光显影(美国alpha公司)，结果如图6所示。
[0087]
实施例6、重组病毒mcmv-k181-egfp和mcmv-k181-nluc/green的生长对比
[0088]
nih3t3细胞按5
×
105/孔的密度铺至6孔板。待细胞贴壁后，分别用mcmv-k181-egfp和mcmv-k181-nluc/green感染，感染复数moi为0.01(此时设为感染后0小时)。孵育2小时后换掉培养基。用dmem完全培养基开始培养感染后的细胞；分别在病毒感染后不同时间点2，4，6，8，10，12天收取培养上清样本并保存于-80℃。当所有的病毒样品收集完成后按照以下步骤测定每个样本的病毒滴度。
[0089]
病毒滴度测定步骤如下:病毒测定前一天按1.5
×
106细胞/孔的密度将nih3t3细胞传代至24孔板。病毒滴定当天，用dmem完全培养基10倍梯度稀释收集的k181-egfp和k181-nluc/green感染的培养基上清样本，每个浓度重复测定三次，每孔加200μl病毒液。3小时后，将19ml预热的dmem完全培养基与6ml微波加热融化的2％灭菌琼脂迅速混匀，冷却至约40℃左右按每孔1ml加入24孔板中。培养72小时，直至最低浓度出现的空斑数不再增加。然后数空斑、计算滴度，结果如图7所示。
[0090]
实施例7、重组病毒mcmv-k181-egfp和mcmv-k181-nluc/green在nih3t3细胞中的荧光强度
[0091]
k181-egfp和k181-nluc/green感染nih3t3细胞的moi为0.01，感染后每24小时观察绿色荧光信号。在相同条件下拍摄的图像。k181-nluc/green显著强于k181-egfp(结果如图8所示)。
[0092]
实施例8、重组病毒mcmv-k181-nluc/green在病毒复制研究中的应用
[0093]
将生长状态良好的nih3t3细胞按1.5
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106细胞/孔的密度铺至12孔板，在37℃，5％co2条件下培养，待细胞贴壁后，分别用k181-egfp病毒和k181-nluc/green重组病毒以不同的moi感染细胞。48小时后收集细胞和培养基上清样品；细胞培养基上清按照实施例6中所述空斑法对病毒进行滴定。细胞样品测定按照nano glo luciferase assay system(cat.#n1120，美国promega公司)说明书测定nanoluc的活性。具体操作如下：
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a)吸去多余细胞培养基，加入200μl glo lysis buffer，室温摇床震荡裂解15分钟；
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b)每孔取10μl裂解液加入50μl平衡到室温的nano glo luciferase assay reagent中并混匀；于化学发光仪(luminometer)中检测nanoluc报告基因的活性；结果如图9所示。细胞上清中病毒的滴度与nanoluc报告基因的活性的关系如图10所示。
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结果显示，mcmv-k181-nluc/green在感染后48小时，nanoluc的活性与感染复数正相关；病毒上清中病毒滴度按以10为底的对数值表示，数值与nanoluc的活性呈线性正相关关系。
[0097]
实施例9、利用重组病毒mcmv-k181-nluc/green评估更昔洛韦(gcv)对mcmv在新生鼠体内传播的抗病毒保护效果
[0098]
为了验证mcmv-k181-nluc/green能否应用于针对cmv潜在药物、中和抗体、疫苗等在体内的效果。发明人在动物生物安全二级实验室(absl 2)中，利用icr小鼠开展了体内攻毒实验，具体流程图见图11。将12只新生icr小鼠，分为三组：对照组(pbs)、安慰剂组(dmso)、更昔洛韦(gcv)治疗组。通过侧脑室注射(i.c.)的方式将1μl(4
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105pfu)mcmv-k181-nluc/green病毒溶液注入新生鼠(p0)侧脑室中，建立mcmv病毒脑部感染模型，p1(攻毒1天后)药物处理，每天给与小鼠50mg/kg gcv至感染后第七天，并在感染后第1，3，5，7，9，11，14天经腹腔注射nanoluc底物(cat.#n1120，美国promega公司)，通过ivis小动物活体成像系统(美国caliper life sciences公司)对mcmv在小鼠体内感染、感染进程和病毒分布情况进行实时监测(图12，每组展示一只代表性结果)，再通过活体成像软件(living image software,version4.5；美国caliper life sciences公司)对荧光值进行定量扫描分析；获得病毒感染实时的时空分布。结果见图13。
[0099]
另外，在小鼠感染7天后，分别从安慰剂组与gcv治疗组中随机选取一只小鼠，经腹腔注射nanoluc底物，通过ivis小动物活体成像系统(美国caliper life sciences公司)观察mcmv在小鼠体内的分布情况；随后将其迅速解剖，取小鼠各脏器组织，通过荧光活性等评价不同组小鼠各脏器组织中mcmv病毒的含量。实验结果如图14与图15所示。结果表明：1)病毒感染的安慰剂组：小鼠脑部、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨髓、脊椎等部位可检测到nluc的信号；在脊椎与脑部观察到明显gfp信号，表明该模型可以监测mcmv在体内感染的时空分布情况。2)病毒感染的gcv治疗组：gcv处理7天后，小鼠各脏器中观察不到明显的nluc信号与gfp信号，结果表明gcv治疗可以有效的减少mcmv在体内的复制和传播范围，(图14和15)。说明k181-nluc/green可以应用于针对mcmv的抗病毒药物抗病毒疗效评估；也适用于中和抗体、疫苗以及其他潜在药物的体内效果评估。
[0100]
综上所述，本发明提供了mcmv可视化的示踪系统，结合绿色荧光蛋白、荧光素酶报告基因和活体成像系统，可以非侵入性检测mcmv在体内的复制水平，同时，本发明开展了icr新生鼠进行抗mcmv病毒药物体内药效验证的研究，展示了利用该模型进行抗mcmv病毒药物研发的应用场景。
[0101]
尽管本发明参照特异的实施方式来描述，但是将被理解的是，实施例是说明性的，本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明的范围由所附的权利要求被描述，由前面的描述所支持。
[0102]
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