类器官培养基及其应用以及血管化肝脏类器官及其构建方法与流程

本发明涉及类器官培养，具体涉及一种类器官培养基及其应用以及血管化肝脏类器官及其构建方法。

背景技术：

1、类器官是近年来发展起来的一种体外三维细胞培养技术，其包含代表器官的一些关键特征，与传统的单一种类细胞的二维或三维培养物相比，类器官能够更好地重现对应器官的部分功能，使其在药物开发和疾病研究中发挥重要作用。

2、随着细胞生物学技术的快速发展，科学家还发现，类器官不仅可以作为体外实验模型，还因其具有与体内肝脏相似的结构特征、生理功能和药物反应性的特点，从而具有用于替代肝移植的潜力。

3、然而，将肝类器官用于临床目前尚仅存在于理论中，在研究中还存在许多技术障碍，阻碍了肝类器官临床应用的进程。其中最主要的原因在于，在类器官的形成和发育过程中，当类器官达到一定大小后会停止扩增，并出现坏死核心。研究认为，这种现象的主要原因可能是类器官本身不具备血管结构，随着类器官体积的整张，受限于氧气缺乏和代谢废物的堆积，最终导致细胞凋亡，产生组织坏死现象。因此，如何实现肝类器官的血管化成为推进肝类器官进入临床应用的关键问题。

4、虽然目前已有一些研究人员开发出多种肝血管化方案，但是其仍存在不同的问题，阻碍采用这些方法制备的肝类器官的临床应用。例如，2011年baptista等使用灌注洗涤剂去除小鼠肝组织中的细胞成分，保留了完整的血管网络，将人脐静脉内皮细胞(huvec)和人胎肝细胞(hflcs)接种到脱细胞支架中，利用肝脏内部的血管网络，实现了肝组织的血管化。但是此种模型仅仅是在小鼠的肝脏支架中，构建了huvec细胞系形成的血管网络，不具备肝脏的功能。而且，huvec对于人体而言属于异种细胞，移植含有由该细胞构成的血管网络的血管化肝类器官时很可能出现排异和功能缺失，导致移植后的类器官无法具有应有的功能。

5、由此可见，开发出即具有完全功能，又不易产生排异问题的血管化肝类器官是目前肝类器官临床应用的关键问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的肝脏类器官血管化困难，而且现有的血管化肝类器官仍存在功能缺失或易产生排异，从而难以实现临床应用的问题，提供一种类器官培养基及其应用以及血管化肝脏类器官及其构建方法。本发明提供的血管化肝脏类器官具有尺寸更大、功能更加成熟、血管化效果好的优点。

2、为了实现上述目的，本发明一方面提供一种类器官培养基，所述培养基包括基础培养基和营养添加剂，其中，所述基础培养基中的糖含量不超过2000mg/l。

3、本发明第二方面提供第一方面所述的培养基在类器官培养中的应用，尤其是在血管类器官或肝脏类器官培养中的应用。

4、本发明第三方面提供一种血管化肝脏类器官，所述血管化肝脏类器官包括具有血管全层结构的微血管类器官和围绕在该血管类器官上的肝脏类器官。

5、本发明第四方面提供一种构建血管化肝脏类器官的方法，所述方法包括分别将干细胞诱导分化形成微血管类器官和肝脏类器官，再将所述微血管类器官和肝脏类器官进行共培养。

6、通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：

7、(1)本发明提供的方法形成的血管化肝脏类器官中的微血管网中包含内皮细胞、周细胞和血管平滑肌细胞，具备完整的微小血管的官腔结构和功能。

8、(2)本发明提供的方法中，采用悬浮培养的方式将微血管类器官和肝脏类器官共培养，从而形成血管化肝类器官，这种悬浮培养的方式使得微血管网络不受基质胶的限制，更容易在培养过程中与肝类器官进行融合。而且，以微血管网作为肝类器官生长的支架，能够很好的促进肝类器官的血管化进程，获得更能完全的血管化肝脏类器官。

9、(3)采用本发明提供的方法形成的血管化肝类器官体积更大，成熟度更高，更有利于在临床中应用。

技术特征：

1.一种类器官培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和营养添加剂，其中，所述基础培养基中的糖含量不超过2000mg/l。

2.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述基础培养基选自rpmi-1640培养基、hcm肝细胞基础培养基和dmem/f12培养基中的至少一种；

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其中，所述培养基为系列培养基组合，其包括：

4.权利要求1-3中任意一项所述的培养基在类器官培养中的应用，尤其是在血管类器官或肝脏类器官培养中的应用。

5.一种血管化肝脏类器官，其特征在于，所述血管化肝脏类器官包括具有血管全层结构的微血管类器官和围绕在该血管类器官上的肝脏类器官。

6.一种构建血管化肝脏类器官的方法，其特征在于，所述方法包括分别将干细胞诱导分化形成微血管类器官和肝脏类器官，再将所述微血管类器官和肝脏类器官进行共培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述干细胞为多能干细胞，优选为诱导性多能干细胞；

8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(1)中，所述血管类器官分化培养基为权利要求1-3中任意一项所述的培养基；

9.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(2)中，所述肝脏类器官分化培养基为权利要求1-3中任意一项所述的培养基；

10.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(3)中采用的肝脏类器官血管化培养基包括advanced dmem/f12培养基以及谷氨酰胺补充剂、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、n2添加剂、b27添加剂、n-乙酰半胱氨酸、胃泌素、烟酰胺、a83-01、毛喉素、r-spondin1、wnt3a、表皮生长因子、血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子-2；

技术总结
本发明涉及类器官培养技术领域，公开了一种类器官培养基及其应用以及血管化肝脏类器官及其构建方法。本发明提供的培养基通过选用特定的小分子物质添加到低糖基础培养基中制成，打破了现有技术中通常采用高糖培养基进行类器官构建的传统，降低了培养基成本。利用本发明提供的培养基和方法，能够以较高的成功率和构建效率获得血管化肝脏类器官，其具有完整的微血管结构和围绕微血管生长的肝小叶结构，体积更大，成熟度更高，对于肝脏类器官的临床应用和研究具有推动作用。

技术研发人员：郑乐民,郭志英,杜建英,连雨璇,宫晓艳
受保护的技术使用者：郑乐民
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13