一种基于核酸纳米结构的基因递送系统及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药，涉及一种基于核酸纳米结构的基因递送系统及其制备方法和应用。

背景技术：

1、研究发现，人类的很多疾病是由于相关基因缺陷或突变造成的。因此，可以通过补充或纠正相关基因来治疗或预防疾病，即为基因疗法。随着分子生物学技术的发展，基因疗法逐渐受到越来越多的关注，各种类型的基因递送策略已经被用于治疗许多严重的基因相关疾病。大多数由特定基因缺陷引起的疾病(如由编码凝血因子的基因突变引起的血友病)都可以通过递送缺失的基因来治疗。由蛋白错误折叠引起的疾病(如亨廷顿舞蹈症)则可以通过递送小核酸(如反义核酸，小干扰rna)下调相关基因的表达进行治疗。另外，基因疗法还有望通过上调抑癌基因或下调肿瘤相关基因来治疗肿瘤。然而，基因治疗的疗效极大程度上依赖基因递送载体的递送效率。因此，亟需开发高效的基因递送策略用于精准的基因治疗。

2、基于病毒载体的基因药物，如治疗脂蛋白酯酶缺乏症(lpld)的glybera和治疗儿童腺苷脱氨酶重症联合免疫缺陷(ada-scid)的strimvelis，已经被批准用于临床。然而，病毒载体能够递送的核酸长度有限，且存在随机插入基因组进而诱发基因突变的风险。因此，越来越多的非病毒载体，包括聚合物、脂质体和无机纳米颗粒等已经被用于向细胞甚至动物活体内递送带有目标基因的质粒。这些被递送的质粒往往带有大量不必要的未甲基化cpg基序和细菌内的残留物质，如脂多糖(lps)，可能会导致不良的免疫反应。另外，动物活体水平研究表明，上述非病毒载体也具有一定的系统毒性和免疫原性，限制了其广泛应用。

3、核酸纳米结构具有精确的结构可编程性、空间可寻址性和良好的生物相容性，已经在生物传感、生物成像和药物递送等生物医药领域展现出极大的应用潜力。此外，核酸自组装体系遵循高度特异性的碱基互补配对原则，使得核酸纳米结构作为载药系统在递送核酸等基因治疗药物方面有着天然的优势。因此，开发一种能够精确装载和靶向递送双链功能基因的核酸纳米结构，在基因治疗药物的研发领域具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种基于核酸纳米结构的基因递送系统及其制备方法和应用，所述核酸纳米结构由核酸脚手架链和多个核酸订书钉链通过碱基互补配对自组装形成，能够高效靶向递送双链核酸，生物安全性好，提高了基因表达效果。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种基于核酸纳米结构的基因递送系统，所述基因递送系统包括核酸脚手架链和核酸订书钉链，所述核酸脚手架链包括目标基因的正义链和反义链的全部核酸序列，所述核酸脚手架链与核酸订书钉链通过碱基互补配对自组装形成核酸纳米结构。

4、本发明中，通过合理的序列和结构设计，将目标基因的正义链和反义链的全部核酸序列作为核酸脚手架链，与多个核酸订书钉链通过碱基互补配对自组装形成核酸纳米结构，所述核酸纳米结构不仅作为药物递送系统将行使基因表达功能的双链核酸递送至细胞内，而且作为药物本身发挥基因表达功能。

5、优选地，所述核酸订书钉链上含有核酸捕获链。

6、优选地，所述基因递送系统还包括修饰有脂质分子的核酸杂交链。

7、优选地，所述修饰有脂质分子的核酸杂交链与所述核酸捕获链通过碱基互补配对连接。

8、优选地，所述脂质分子包括1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺中任意一种或至少两种的组合。

9、本发明中，依托高特异性的碱基互补配对原则定点锚定脂质分子，通过疏水相互作用在核酸纳米结构表面修饰具有细胞靶向和内涵体逃逸功能的脂质分子，提高了核酸纳米结构递送长链核酸的靶向性和递送效率，原理示意图如图1所示。

10、优选地，所述修饰有脂质分子的核酸杂交链的5’端具有hs-shc6修饰，其核酸序列包括seq id no:50所示的序列。

11、seq id no:50：

12、hs-shc6-tttttacgtgacacgttcggagaatt。

13、优选地，所述基因递送系统还含有辅助脂质，所述辅助脂质可行使细胞靶向和/或内涵体逃逸功能。

14、优选地，所述辅助脂质与所述脂质分子通过疏水相互作用结合到核酸纳米结构上。

15、优选地，所述核酸捕获链和所述修饰有脂质分子的核酸杂交链的摩尔比为1:(1～1.5)，例如可以是1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，优选为1:1.5。

16、优选地，所述修饰有脂质分子的核酸杂交链和辅助脂质的摩尔比为1:(250～1000)，例如可以是1:250、1:500、1:600、1:700、1:800或1:1000，优选为1:500。

17、优选地，所述辅助脂质包括阳离子脂质、中性脂质或聚乙二醇化脂质中任意一种或至少两种的组合。

18、优选地，所述阳离子脂质包括n-(2,3-二油基氧基)丙基-n,n,n-三乙基氯化铵(dotma)、n-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-n-2-(精胺甲酰胺基)乙基)-n,n-二甲基三氟乙酸铵(dospa)或n-(2,3-二油基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)中的任意一种或至少两种的组合。

19、优选地，所述中性脂质包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(dope)或叶酸修饰的1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(fa-dope)中的任意一种或至少两种的组合。

20、优选地，所述聚乙二醇化脂质包括甲氧基聚乙二醇2000双十四烷基乙酰胺(alc-0159)和/或1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(peg2000-dmg)。

21、本发明中，在核酸纳米结构上修饰具有细胞靶向和内涵体逃逸功能的脂质分子，提高了核酸纳米结构的靶向递送效率。

22、优选地，所述辅助脂质修饰有能够识别细胞表面受体的靶向配体。

23、可以理解，所述目标基因可以是任意基因，例如可以是模式基因(如egfp基因)、肿瘤发生发展相关基因(如p53基因)或其他疾病相关基因(如神经紊乱相关基因、抗肿瘤相关的细胞内源蛋白编码基因以及外源的用于杀伤肿瘤的毒性蛋白编码基因和基因遗传病相关基因等)。

24、优选地，所述目标基因包括绿色荧光蛋白(egfp)编码基因(其编码框的长度为720个碱基)，所述核酸订书钉链的核酸序列包括seq id no:5～49所示序列，其中，seq id no:5～25为以正义链为核酸脚手架链的核酸订书钉链，seq id no:26～49为以反义链为核酸脚手架链的核酸订书钉链。

25、seq id no:5：ctcggcgcgggtcttggtcgtccttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

26、seq id no:6：tgaagaagtaggtcagggtggtcaggccagggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

27、seq id no:7：cacgggcacgccgtccagctcgacgcaccacctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

28、seq id no:8：ctcctggacgccctcgaacttcactttttaattctccgaacgtgtcacgt；

29、seq id no:9：gtggtgcagaagcactgcacgccgatggtgcgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

30、seq id no:10：cggttcaccagggtgtcgtagccttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

31、seq id no:11：tcgggcatggtcggggtagcggctgatgaacttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

32、seq id no:12：tgaagaaggcccttcagctcgatgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

33、seq id no:13：gctgccgttcgtgctgcttcatgtggcggacttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

34、seq id no:14：cctccttgaagtcgatcctcgatgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

35、seq id no:15：ttgtggcgagctgcac；

36、seq id no:16：agttcacccccaggatgttgccgttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

37、seq id no:17：tctttgctctggtagtggtcggcggatcttgatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

38、seq id no:18：gtactccagcttgtgcttgatgcctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

39、seq id no:19：gttcttctcgatgggggtgttctgcagggcggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

40、seq id no:20：gccatgattgtggctgttgtagtttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

41、seq id no:21：gtggttgtagcacggggccgtcgcgcttgtcgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

42、seq id no:22：tcagggtcgccggacacgctgaacccatcctgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

43、seq id no:23：

44、acgtaaaccatcgccctcgccctcagcttgccgtaggtggatgtgatctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

45、seq id no:24：gcgcttctgaactccagcaggaccccgccctgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

46、seq id no:25：actgggtgtccatgccgagagtgagatcacattttttaattctccgaacgtgtcacgt；

47、seq id no:26：cggcaagcagtccgccatgcccgatccaggagtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

48、seq id no:27：cgcaccatcttcttcatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

49、seq id no:28：ccctggccgggcgatg；

50、seq id no:29：aggacgaccagcacgacttcttcatgcccgtgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

51、seq id no:30：gtcgagcttgtccggcgagggcgacaccctcgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

52、seq id no:31：tgaccaccccccgaccacatgaagggcaactatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

53、seq id no:32：caagacccgcgccgagtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

54、seq id no:33：cacccagtggccacaagttcagcgggacggcgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

55、seq id no:34：agccgctactgacctacggcgtgcggcatcaatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

56、seq id no:35：gtgaagttagtgcttc；

57、seq id no:36：agcaaagatacctgag；

58、seq id no:37：ggtgaactcgacaagcagaagaaccgagggcgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

59、seq id no:38：acaccctggtgaaccgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

60、seq id no:39：catcgagcacgtctatatcatggctcaagatctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

61、seq id no:40：cgccacaagctgcccg；

62、seq id no:41：ggtcctgcgcgacggccccgtgctcatcgaggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

63、seq id no:42：acggcagcaactacaacagccacatgaagggctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

64、seq id no:43：atcgacttcaaggaggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

65、seq id no:44：cgccgacccagaacacccccatcgtggagttctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

66、seq id no:45：acggcaacgcacaagctggagtacgtgcagcttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

67、seq id no:46：ccggtgaaggcaagctgaccctgatgcaccactttttaattctccgaacgtgtcacgt；

68、seq id no:47：

69、ccacctacttcaccggggtggtgcttgtggccgtttacgtgcttgccgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

70、seq id no:48：

71、acaaccacccccaacgagaagcgctcccggcggcggtcaccgttggggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

72、seq id no:49：gtgaccgctcactctcggcatggactcaggtatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

73、优选地，所述目标基因包括p53蛋白编码基因(其编码框的长度为1182个碱基)，所述核酸订书钉链的核酸序列包括seq id no:51～127所示的序列，其中，seq id no:51～86为以正义链为核酸脚手架链的核酸订书钉链，seq id no:87～127为以反义链为核酸脚手架链的核酸订书钉链；

74、seq id no:51：tgcttgtaagcgcctcacaacctctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

75、seq id no:52：ctggtgcaagggacagaagatgacgctgtgactttttaattctccgaacgtgtcacgt；

76、seq id no:53：gacgctagtctgaaaatgtttcctggagggggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

77、seq id no:54：cgctcatggtgggggcgatggccatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

78、seq id no:55：tggcgcggggtaggttttctgggaggggccgctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

79、seq id no:56：gccgggcgatcgctatctgagcagtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

80、seq id no:57：ggtgcaggaaaccgtagctgccctacgcgggttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

81、seq id no:58：gaggaggggccagaccggggtgtgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

82、seq id no:59：gaatcaaccaagaagcccagacggggccacggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

83、seq id no:60：gcacagggactcggataagatgcttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

84、seq id no:61：cattctggtggctgtcccagaatgccacagcttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

85、seq id no:62：acgcaaatttccttcccaggtctttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

86、seq id no:63：ggccagttgtgcaagtcacagactgagcttcatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

87、seq id no:64：atcttgttcatccaaatactccactttttaattctccgaacgtgtcacgt；

88、seq id no:65：tctcttccgagggcaggggagtacggcaaaactttttaattctccgaacgtgtcacgt；

89、seq id no:66：cgaaaagtgtttctgttctgtgcgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

90、seq id no:67：ccggtctcgcggagat；

91、seq id no:68：caggcacacaccaccacactatgttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

92、seq id no:69：ctgggcatgaggctcccctttctttcccaggatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

93、seq id no:70：caggcggctcatagggaacacgcatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

94、seq id no:71：cctcaaaggggggcagctcgtggtccttgagttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

95、seq id no:72：tcccagtacagtcagagccaaccttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

96、seq id no:73：gctctcggtcgcttagtgctccctctgttccgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

97、seq id no:74：gtagtggatggtggtagattaccatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

98、seq id no:75：ctggagtctgttgttgggcagtgcaacatctctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

99、seq id no:76：tgatgatgtgttacacatgtagtttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

100、seq id no:77：cggatctgtggggagaggagctggttccagtgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

101、seq id no:78：ccgcccatgcaggaacgtgaggattttttaattctccgaacgtgtcacgt；

102、seq id no:79：gggcctcctggtttcttctttggcaagggtgatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

103、seq id no:80：cggtgtagaagtagtttccataggctagcgtctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

104、seq id no:81：ggggagcagacggcaagggggacattttcagatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

105、seq id no:82：tctggaccccggggacagcatcaacaacgttctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

106、seq id no:83：

107、ccaagcaacattgttcaatatcgttgggtcttcagtgaacgctccccctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

108、seq id no:84：ctggctccggctggagtgagccctactcaaggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

109、seq id no:85：tccaaggcggaggtagactgacccgggggagctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

110、seq id no:86：gaagcgctccttctgtcttgaacatccaaaaatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

111、seq id no:87：tggccatccacacccccgcccggcctacaccgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

112、seq id no:88：gagcccccccagaggctgctcccctgcaccagtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

113、seq id no:89：ccccctccagctgtgggttgattctacaagcatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

114、seq id no:90：gtcacagcacatgacgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

115、seq id no:91：gtcatctttgaagctc；

116、seq id no:92：gaggttgtaagacctgccctgtgctggccccttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

117、seq id no:93：cctatggaaagacccaggtccagactgtcccttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

118、seq id no:94：tcccagaagttttgccaactggccgaggcgcttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

119、seq id no:95：gcccccaccatgagcgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

120、seq id no:96：agggcagcgaacaatg；

121、seq id no:97：ctgctcagctgccctcaacaagataacctacctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

122、seq id no:98：tgtcccccgtccccggacgatatttacggttttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

123、seq id no:99：ccgtctggacttgcacgtactcccatagcgattttttaattctccgaacgtgtcacgt；

124、seq id no:100：ggtctggcccctcctctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

125、seq id no:101：gccttggatggatgatttgatgctttgccgtctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

126、seq id no:102：agtctgtggcttcttgcattctggtgcgtgtttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

127、seq id no:103：agcatcttgacagcca；

128、seq id no:104：atgcccagtgaatgag；

129、seq id no:105：tgtgcctgcggaacagctttgaggatccgagttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

130、seq id no:106：ggaaggaaatttgcgttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

131、seq id no:107：gagaccgggagatgtt；

132、seq id no:108：gtggagtatggtaatctactgggatcctgggatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

133、seq id no:109：agggctcatgggcgtgagcgcttccgcacagatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

134、seq id no:110：ggaagagacactggaagactccagtttggatgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

135、seq id no:111：acagaaacacttttcgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

136、seq id no:112：aagaaaggtcaccctt；

137、seq id no:113：acatagtgatcctcaccatcatcaatctccgctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

138、seq id no:114：gggtcagtctggatggagaatattggagcctctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

139、seq id no:115：accacgagcatgaaccggaggccctggtggtgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

140、seq id no:116：ccctatgagccgcctgtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

141、seq id no:117：agggagcagccaaaga；

142、seq id no:118：aggttggcgttcctgcatgggcggctgccccctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

143、seq id no:119：tgttcaagccagctcctctccccactaagcgatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

144、seq id no:120：

145、gcactgccaactacatgtgtaacatctgactgtaccaccatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

146、seq id no:121：

147、gcggccccccgtggcccctgcaccgggggctctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

148、seq id no:122：

149、ccagaatgtctgagtcaggaaacagaacgttgttttcagggagctgcttttttaattctccgaacgtgtcacgt；

150、seq id no:123：

151、gttcactgaactacttcctgaaaaatcatccattgcttgggcctctggtttttaattctccgaacgtgtcacgt；

152、seq id no:124：

153、ccgagagcgctgggaaggagccagtttttggacttcaggtttcccagctttttaattctccgaacgtgtcacgt；

154、seq id no:125：

155、cagatccgctccagccacctgaagtgagttttttatggcgctcattcatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

156、seq id no:126：

157、agaaaccactacctcccgccataatcagtctgagtcaggccacgcccatttttaattctccgaacgtgtcacgt；

158、seq id no:127：aatattctgcctgactcagactgaaaaactcatttttaattctccgaacgtgtcacgt。

159、第二方面，本发明提供一种第一方面所述的基于核酸纳米结构的基因递送系统的制备方所述制备方法包括：

160、获取目标基因，分离纯化得到分别含有正义链或反义链的核酸脚手架链；将所述核酸脚手架链与对应的核酸订书钉链进行退火组装，分别形成含有正义链的核酸纳米结构和含有反义链的核酸纳米结构；将所述两种核酸纳米结构进行杂交，得到同时含有正义链和反义链的核酸纳米结构，即为所述基于核酸纳米结构的基因递送系统。

161、优选地，所述目标基因采用pcr扩增含有目标基因的质粒得到。

162、优选地，所述pcr扩增的引物修饰有生物素。

163、优选地，所述引物的核酸序列包括seq id no:1～seq id no:4所示的序列。

164、优选地，所述pcr引物包括seq id no:1～seq id no:2或seq id no:3～seq idno:4所示的核酸序列，其中，seq id no:1～seq id no:2为制备正义链的引物对，seq idno:3～seq id no:4为制备反义链的引物对。

165、seq id no:1(制备正义链的正向引物)：

166、cctcccaagatggcccgataattaatagtaatcaattacg；

167、seq id no:2(制备正义链的反向引物)：

168、生物素-cctcctcttccctgtccaaacttaagatacattgatgagt；

169、seq id no:3(制备反义链的正向引物)：

170、生物素-cctcccaagatggcccgataattaatagtaatcaattacg；

171、seq id no:4(制备反义链的反向引物)：

172、cctcctcttccctgtccaaacttaagatacattgatgagt。

173、优选地，所述分离纯化采用磁珠分离，优选为链霉亲和素修饰的磁珠，得到的目标基因的正义链和反义链用作核酸脚手架链。

174、优选地，所述核酸脚手架链和核酸订书钉链的摩尔比为1:(5～10)，例如可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:10。

175、优选地，所述退火组装的条件为90～98℃保持2～10min，在8～15h内逐渐冷却至20～30℃，优选为95℃保持5min，在12h内逐渐冷却至20～30℃。

176、优选地，所述含有正义链的核酸纳米结构和含有反义链的核酸纳米结构的摩尔比为1:(0.5～1.5)，包括但不限于1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，优选为1:1。

177、优选地，所述杂交的条件为30～40℃保持0.5～3h，降温至2～6℃，优选为，37℃保持1h，降温至4℃。

178、优选地，所述核酸订书钉链含有核酸捕获链。

179、优选地，所述制备方法还包括将所述同时含有正义链和反义链的核酸纳米结构与修饰有脂质分子的核酸杂交链进行杂交，并与辅助脂质进行共孵育，得到脂质包裹的基因递送系统。

180、本发明中，核酸杂交链同脂质之间通过有机共价反应连接。

181、优选地，所述核酸杂交链和脂质分子的摩尔比为1:(10～30)，例如可以是1:10、1:15、1:20、1:25或1:30，优选为1:30。

182、优选地，所述核酸捕获链和所述修饰有脂质分子的核酸杂交链的摩尔比为1:(1～1.5)，例如可以是1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，优选为1:1.5。

183、优选地，所述杂交的条件为30～40℃保持0.5～3h，降温至2～6℃，优选为，37℃保持1h，降温至4℃。

184、本发明中，核酸纳米结构进行杂交的条件是特定的过程，在37℃下保持1h，修饰有脂质分子的杂交链可以高效锚定在核酸纳米结构上；如果温度低于37℃，则无法打开杂交链和捕获链的二级结构，导致杂交效率降低；如果温度高于37℃，则有可能导致核酸纳米结构解组装。

185、优选地，所述修饰有脂质分子的核酸杂交链和辅助脂质的摩尔比为1:(250～1000)，例如可以是1:250、1:500、1:600、1:700、1:800或1:1000，优选为1:500。

186、优选地，所述共孵育的条件为20～30℃反应30～60min并透析8～16h。

187、第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的基于核酸纳米结构的基因递送系统。

188、优选地，所述药物组合物还包括辅料。

189、优选地，所述辅料包括药学上可接受的载体、润湿剂、增溶剂、渗透压调节剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

190、第四方面，本发明提供第一方面所述的基于核酸纳米结构的基因递送系统或第三方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

191、优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞癌或宫颈癌中的任意一种或至少两种的组合。

192、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

193、(1)本发明的核酸纳米结构将目标基因的正义链和反义链整合在一个核酸结构上，实现了双链核酸的精确装载；依托高特异性的碱基互补配对原则定点锚定脂质分子，通过疏水相互作用在核酸纳米结构表面修饰具有细胞靶向和内涵体逃逸功能的脂质分子，提高了核酸纳米结构递送长链核酸的靶向性和递送效率；

194、(2)本发明的核酸纳米结构中的目标基因是任意的，通用性强，不涉及复杂的有机合成等化学反应过程，只需要简单的核酸共组装即可得到，制备方法简单，可实现大规模生产；

195、(3)从生物安全性方面考虑，本发明的核酸纳米结构与聚合物、脂质体和无机纳米颗粒等载体相比，具有良好的生物相容性和较低的毒副作用，在药物递送方面潜力巨大，可以应用于更广泛的生物疾病模型。