用于检测猫弓形虫的引物组合物、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物工程，具体涉及用于检测猫弓形虫的的引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、弓形虫病是由肉孢子虫科(sarcocystidae)弓形虫属(toxoplasma)的刚第弓形虫(toxoplasma gondii)引起的一种在世界范围内分布的人畜共患病，包括人在内的200多种动物均可感染。猫是其终末宿主，人畜和禽类等其他动物为中间宿主。由于宠物猫日常与人类相处密切，使其成为人类感染的重要来源。被寄生动物排出含弓形虫卵囊的粪便污染食物、食具、水源等外界环境就可以引起人和动物的弓形虫感染。弓形虫既可以通过消化道、呼吸道以及胎盘感染，还可以通过宿主受损的皮肤黏膜发生感染。弓形虫感染人在某些情况下，后果非常严重，例如妊娠期间的胎儿和免疫缺陷的人群。弓形虫感染多数呈无症状隐形感染，因此建立弓形虫检测方法变得尤为重要。目前实验室诊断弓形虫的方法有：elisa、凝集试验、间接荧光试验、pcr、lamp等。其中临床常用的检测方法为rt-pcr。pcr技术因敏感性高、特异性强、费用低等优点已成为一种经典的检测方法，广泛用于弓形虫的检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有对猫弓形虫检测的试剂盒操作复杂、特异性差、灵敏度低及检测结果准确性不高等问题。

2、为此，本发明提供了一种用于检测猫弓形虫的引物组合物，包括正向引物、反向引物；

3、所述正向引物的序列为5’-gctcgcctgtgcttggag-3’；

4、所述反向引物的序列为5’-atcttctccctctccgactctc-3’。

5、具体的，上述引物组合物还包括探针；

6、所述探针的序列为5’-tcgcttcccaaccacgccacc-3’。

7、具体的，上述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。

8、本发明还提供了一种用于检测猫弓形虫的试剂盒，包括pcr反应液；所述pcr反应液包括上述用于检测猫弓形虫的引物组合物。

9、具体的，上述pcr反应液包括1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1.0μm的正向引物、0.1-1.0μm的反向引物、0.1μm的探针。

10、具体的，上述试剂盒还包括酶混合液；所述酶混合液包括1-5u/μl的dna聚合酶和1-5u/μl热启动修饰抗体。

11、具体的，上述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为猫弓形虫阳性样本；所述阴性对照为超纯水。

12、本发明还提供了一种检测猫弓形虫的的方法，包括以下步骤：

13、(1)提取待测样本的dna；

14、(2)以待测样本的dna为模板，利用上述引物组合物进行荧光定量pcr反应；

15、(3)pcr反应结束后，根据ct值判定检测结果。

16、具体的，上述步骤(2)中pcr反应程序为：95℃，3min；95℃，10s，58℃，20s，40个循环。

17、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

18、本发明提供的这种用于检测猫弓形虫的引物组合物耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高，最低检测限为10copies/μl，敏感性是普通pcr的100倍以上，为临床猫弓形虫的检测提供了保障。

19、以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

技术特征：

1.一种用于检测猫弓形虫的引物组合物，其特征在于：包括正向引物、反向引物；

2.如权利要求1所述的用于检测猫弓形虫的引物组合物，其特征在于：还包括探针；

3.如权利要求2所述的用于检测猫弓形虫的引物组合物，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种；所述荧光淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的一种。

4.一种用于检测猫弓形虫的试剂盒，其特征在于：包括pcr反应液；所述pcr反应液包括权利要求1-3任意一项所述的用于检测猫弓形虫的引物组合物。

5.如权利要求4所述的用于检测猫弓形虫的试剂盒，其特征在于：所述pcr反应液包括1-5mm的mgcl2、20-50mm的tris、100-500mg/l的bsa、10-100μm的dntps、0.1-1.0μm的正向引物、0.1-1.0μm的反向引物、0.1μm的探针。

6.如权利要求4所述的用于检测猫弓形虫的试剂盒，其特征在于：还包括酶混合液；所述酶混合液包括1-5u/μl的dna聚合酶和1-5u/μl热启动修饰抗体。

7.如权利要求4所述的用于检测猫弓形虫的试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为猫弓形虫阳性样本；所述阴性对照为超纯水。

8.一种检测猫弓形虫的的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.如权利要求8所述的检测猫弓形虫的的方法，其特征在于：所述步骤(2)中pcr反应程序为：95℃，3min；95℃，10s，58℃，20s，40个循环。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，具体提供了用于检测猫弓形虫的的引物组合物、试剂盒及方法。本发明提供的用于检测猫弓形虫的的引物组合物正向引物、反向引物；所述正向引物的序列为5’‑GCTCGCCTGTGCTTGGAG‑3’；所述反向引物的序列为5’‑ATCTTCTCCCTCTCCGACTCTC‑3’。本发明提供的这种用于检测猫弓形虫的引物组合物耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高，最低检测限为10copies/μL，敏感性是普通PCR的100倍以上，为临床猫弓形虫的检测提供了保障。

技术研发人员：胡雨晴,张炳为
受保护的技术使用者：苏州中科先进技术研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12