一株甜菜夜蛾细胞系

1.本发明属于农业和生物技术领域，具体涉及一株甜菜夜蛾细胞系，适合于杆状病毒与昆虫宿主互作以及昆虫抗病毒机制的研究。


背景技术：

2.昆虫杆状病毒作为生物杀虫剂，因其具有环境友好性、宿主特异性和防治后效作用明显等优点，在害虫生物防治中发挥着重要作用，具有广阔的应用前景。在宿主昆虫与病毒的共同进化过程中，一方面宿主昆虫可通过免疫反应抵御病毒的入侵，另一方面病毒针对宿主免疫也会进化出抑制或逃避的响应。因此，宿主昆虫与病毒的相互关系以及昆虫抗病毒机制的研究对于提高害虫生物防治效果显得尤为重要。
3.昆虫属于无脊椎动物，与高等脊椎动物相比缺少获得性免疫系统，不会对入侵的病毒产生特异的抗体，而是在与病毒的长期互作中形成了一套独特的先天免疫系统。宿主昆虫可通过细胞凋亡、激活免疫信号转导通路以及效应机制等多种过程完成对病毒的杀灭和清除。
4.昆虫细胞系在生物学、农业以及医学领域的研究和应用方面发挥着重要的作用，尤其是昆虫病毒学研究的重要工具，为研究提供了简单、快速和准确的手段以及理想的体外模型。自1959年高尚荫首次建立了家蚕卵巢细胞系和1962年grace成功建立传代的桉蚕antheraea eucalypti细胞系以来，世界各地已从170多种昆虫中建立了800多个细胞系。目前，细胞系在细胞凋亡、免疫信号转导通路等抗病毒免疫途径研究中的应用日益受到人们的关注，建立和筛选具有不同生物学特性的新昆虫细胞系，并从中发掘具有抗病毒功能的细胞系，将为杆状病毒与昆虫宿主互作以及昆虫抗病毒机制的研究提供有价值的实验材料，具有重要的意义和广阔的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明提供一株甜菜夜蛾细胞系，该细胞系对杆状病毒代表种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,acmnpv)的感染表现为细胞发生凋亡现象，病毒产量显著降低，细胞凋亡核心基因被激活。但该细胞系对甜菜夜蛾核型多角体病毒(spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,semnpv)的感染不敏感，相关抗菌肽基因被激活。该细胞系是适合于杆状病毒与昆虫宿主互作以及昆虫抗病毒机制研究的优良实验细胞系。
6.本发明所提供的昆虫细胞系，为甜菜夜蛾细胞系qau-se-1-rv(spodoptera exigua cell line qau-se-1-rv，简称se-1-rv)，于2022年12月2日保藏在位于武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c2022345。
7.本发明所提供的细胞系经线粒体细胞色素氧化酶i亚基(coi)基因片段序列鉴定为甜菜夜蛾细胞系，其中coi基因片段核苷酸序列为seq id no:1，其蛋白序列为seq id no:2。
8.本发明所提供的细胞系对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)侵染后表现为细胞凋亡，病毒产量显著降低。
9.本发明所提供的细胞系对甜菜夜蛾核型多角体病毒(semnpv)不敏感，接种semnpv后未发现细胞出现典型的病毒感染症状。
10.本发明所提供的细胞系se-1-rv可用于病毒与宿主细胞间的互作和宿主昆虫抗病毒机制的研究。
附图说明
11.图1为细胞系se-1-rv的形态图；
12.图2为acmnpv感染细胞系se-1-rv的形态图；
13.图3为acmnpv感染se-1-rv细胞和se-3细胞(对照)的病毒产量图，其中a为出芽型病毒粒子(bv)的产量，b为病毒多角体(ob)的产量；
14.图4为acmnpv感染se-1-rv细胞不同时间后细胞凋亡核心基因casepase的表达变化图，其中a、b、c、d、e、f分别为caspase1、caspase2、caspase3、caspase4、caspase5、caspase6基因的表达变化；
15.图5为semnpv感染se-1-rv细胞和se-3细胞(对照)的病毒产量图；
16.图6为semnpv感染se-1-rv细胞后抗菌肽基因的表达变化图，其中a、b、c、d、e、f、g、h分别为gloverin、attacin1-1、attacin1-2、attacin2、attacin3、lebocin1、lebocin2、cecropin a基因的表达变化。
具体实施方式
17.本发明成功克隆筛选了一株甜菜夜蛾细胞系qau-se-1-rv(spodoptera exigua cell line qau-se-1-rv)，保藏号为：cctcc no:c2022345；保存时间为：2022年12月2日；保存单位是：中国典型培养物保藏中心。
18.细胞系se-1-rv的细胞形态均为圆形，细胞直径为15.46
±
1.37μm；se-1-rv细胞coⅰ基因片段序列分析与甜菜夜蛾coⅰ基因片段序列的一致性为100％，该细胞系为甜菜夜蛾细胞系；该细胞系被苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)侵染后细胞发生凋亡现象，病毒产量显著降低；该细胞系对甜菜夜蛾核型多角体病毒(semnpv)高度不敏感，接种semnpv后未发现细胞出现典型的病毒感染症状，细胞系se-1-rv在细胞凋亡机制研究和宿主昆虫抗病毒机制研究等方面具有良好的应用前景。
19.下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
20.实施例1细胞系se-1-rv的克隆及其鉴定
21.1.1细胞系se-1-rv的克隆
22.在建立的甜菜夜蛾细胞系se-1(su r,zheng g,wan f,li c.establishment and characterization of three embryonic cell lines of beet armyworm,spodoptera exigua(lepidoptera:noctuidae).cytotechnology.2016,68(4):1223-1232)的基础上，选取传代21次的状态良好的对数生长期细胞，稀释至一定的浓度接种于6孔培养板中，待细胞贴壁后在显微镜下观察，用记号笔在6孔培养板底部标记只有一个细胞的位置，每天进行观察，待标记的细胞长出细胞集落，在超净工作台内小心吸出培养基，用镊子夹取灭菌的克隆
环，蘸取适量灭菌的凡士林，将克隆环小心地固定在标记好的细胞集落上，然后用吸管吸取少量新鲜培养基加入克隆环内吹吸分散细胞，将细胞悬液吸出加入96孔培养板中，用新鲜培养基补足到100μl，置于28℃培养箱中培养，待细胞长满培养孔后，将细胞移入24孔培养板培养，待细胞长满培养孔后再依次移入6孔培养板和25cm2细胞培养瓶中，待细胞生长稳定后，再重复上述克隆步骤2-3次，获得细胞克隆株，命名并对细胞克隆株的生物学特性进行测定。
23.先后共获得了56个细胞克隆株，通过测定不同细胞克隆株对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)和甜菜夜蛾核型多角体病毒(semnpv)侵染的反应，筛选获得了一个性能优良的细胞株，命名为qau-se-1-rv(简称se-1-rv，保藏号为：cctcc no:c2022345；保存时间为：2022年12月2日；保存单位是：中国典型培养物保藏中心)，目前该细胞株在含有10％胎牛血清(fbs)的tnm-fh培养基中已传代超过60次，细胞生长稳定，在液氮中可长期保存。
24.在倒置相差显微镜下(olympus ix71)观察细胞的形态，se-1-rv细胞形态一致，均为圆形，随机选取100个细胞，通过显微标尺测量细胞的大小，细胞的直径为15.46
±
1.37μm(图1)。
25.1.2细胞系se-1-rv的鉴定
26.提取se-1-rv细胞的基因组dna，利用线粒体细胞色素c氧化酶ⅰ(cytochrome c oxidaseⅰ，coⅰ)基因通用引物hco 2198和lco 1490(folmer et al.,1994)进行pcr扩增，pcr产物经电泳检测后进行测序。扩增的se-1-rv细胞系coⅰ基因片段长度为627bp(seq id no:1)，编码209个氨基酸(seq id no:2)，通过序列比较和分析，该片段与ncbi中甜菜夜蛾coⅰ基因片段序列的最大相似率为100％，证明se-1-rv细胞系为甜菜夜蛾细胞系。
27.实施例2细胞系se-1-rv对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)侵染的反应
28.1.1acmnpv诱导细胞系se-1-rv发生细胞凋亡
29.将se-1-rv细胞接种在24孔培养板中，以感染复数(multiplicity of infection，moi)为10的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)对甜菜夜蛾细胞系se-1-rv进行接种，发现se-1-rv细胞在接种acmnpv后持续发生凋亡并形成大量的凋亡小体，只有少数未凋亡的细胞能被acmnpv感染，少数细胞中可以形成病毒多角体(图2)，说明acmnpv感染诱导了se-1-rv细胞产生严重的凋亡反应，影响病毒在细胞的产生。
30.为了进一步分析se-1-rv细胞凋亡对acmnpv复制和产量的影响，以acmnpv可以正常感染的甜菜夜蛾se-3细胞为对照，采用终点稀释法法测定了两个细胞系中出芽型病毒粒子(bv)的滴度(tcid
50
)，并统计了病毒多角体(ob)的产量。结果发现，在acmnpv感染过程中，se-1-rv细胞中的bv滴度显著低于se-3细胞(图3a)，并且se-1-rv细胞中ob的产量也显著低于se-3细胞(图3b)，说明acmnpv感染诱导的se-1-rv细胞凋亡严重影响了病毒bv和ob的产量。
31.1.2acmnpv侵染细胞系se-1-rv后细胞凋亡核心基因的表达变化
32.将se-1-rv细胞接种在24孔培养板中，以moi为10的acmnpv接种细胞，在感染的不同时间点收集细胞，用trlzol试剂提取感染细胞的总rna，参照反转录操作说明书合成cdna。分别利用细胞凋亡核心基因caspase1、caspase2、caspase3、caspase4、caspase5、caspase6的特异性引物和荧光定量pcr(rt-qpcr)技术对上述6个caspase基因进行定量分析，结果如图4所示。在acmnpv感染过程中，caspase1(图4a)、caspase2(图4b)、caspase3(图
4c)、caspase4(图4d)、caspase5(图4e)和caspase6(图4f)等基因的转录水平在感染1h～24h时缓慢升高，在感染24h～96h时显著升高，上述细胞凋亡核心基因在se-1-rv细胞感染acmnpv后均被激活，对细胞凋亡的发生起重要作用，结果为细胞凋亡机制的研究提供理论依据。
33.实施例3细胞系se-1-rv对甜菜夜蛾核型多角体病毒(semnpv)侵染的反应
34.1.1细胞系se-1-rv对semnpv的敏感性测定
35.为检测se-1-rv细胞对甜菜夜蛾核型多角体病毒(semnpv)的敏感性，分别取se-1-rv和se-3(对照)的对数生长期细胞，按2.0
×
105细胞/ml的浓度接入24孔培养板中，每孔1ml；28℃条件下培养2h，使细胞贴壁，吸去培养基，以moi为10的semnpv分别接种两种细胞，每个处理设3个重复，置于垂直摇床上缓慢摇动，吸附2h后弃去病毒液，每孔加入1ml新鲜培养基，28℃培养箱中培养。在倒置显微镜下检查细胞形态和病毒感染结果。发现细胞系se-3接种semnpv后2d开始出现感染症状，细胞核开始膨大，3d能看到细胞核内有多角体形成，4d感染症状明显，细胞内产生大量的多角体，细胞感染率在90％以上，表明细胞系se-3对semnpv非常敏感；而se-1-rv细胞接种semnpv后4d细胞形态上未发生变化，一直未出现明显的病毒感染症状。
36.分别在接种semnpv的不同时间点随机选取三孔细胞，分别提取感染se-1-rv和se-3(对照)两种细胞的总dna，应用荧光定量pcr法测定病毒gp41基因的表达，根据绘制的绝对定量标准曲线检测和分析细胞内的病毒拷贝数。结果(图5)表明，对semnpv敏感的se-3细胞中的病毒产量显著高于se-1-rv细胞中的病毒产量。se-1-rv细胞中有少量病毒复制和产生，但未出现典型的病毒感染症状，表明se-1-rv细胞对semnpv的侵染表现极其不敏感。
37.1.2semnpv侵染细胞系se-1-rv后抗菌肽基因的表达
38.为分析se-1-rv细胞对semnpv侵染不敏感的原因，以moi为10的semnpv接种se-1-rv细胞，分别在接种不同时间收集感染的细胞，每个处理设3次重复，参照rna提取试剂盒操作方法分别提取细胞的总rna，送生物技术公司进行转录组测序。使用fastqc对下机数据进行质控，用star将reads比对到甜菜夜蛾参考基因组上，使用rsem建立索引并对结果文件进行定量，使用deseq2分析抗菌肽基因在转录水平上的变化。转录组分析结果见图6，其中gloverin(图6a)、attacin1-1(图6b)、attacin1-2(图6c)、attacin2(图6d)、attacin3(图6e)、lebocin1(图6f)和lebocin2(图6g)等抗菌肽基因在接种semnpv后12h内的表达量呈显著上升趋势，cecropin a(图6h)在接种semnpv后6h内的表达量也逐渐升高，均显著高于未接种病毒细胞中的表达量，这些抗菌肽的表达可能与se-1-rv细胞抵御semnpv的侵染有关，结果为细胞的抗病毒机制研究奠定了基础。