细胞培养基测试方法及其在生物制药中的应用与流程

本发明属于检测技术和生物制药领域，具体涉及一种细胞培养基测试方法及其在生物制药中的应用。

背景技术：

1、细胞作为产品表达的载体被越来越多的用于现代生物医药生产中，其中哺乳动物细胞是工业生物医药生产的主要宿主，哺乳动物细胞能够产生多样化、正确折叠和糖基化的蛋白质，复杂的蛋白质需要经过正确的翻译后修饰，才会具有药物功能和非免疫原性。细胞的生长和生产离不开细胞培养基，所以细胞培养基的质量把控对于生物制药生产相当重要。

2、现代生物制药生产中一般使用无动物源性的和化学限定的培养基培养细胞。细胞培养基的成分非常复杂，含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)、维生素、缓冲体系、脂类、保护剂等。尽管商品化的培养基的组分一般会根据标准进行配比，但不同批次间的差异仍会导致细胞生长发生异常，甚至进一步影响到生物制品的质量。

3、细胞悬浮培养相较于传统的贴壁培养，可以获得更高的细胞密度(可提高一个数量级)，贴壁培养的细胞密度在105cell/ml(细胞每毫升)级，悬浮培养可以达到106cell/ml级，甚至在流加培养模式中可以达到107cells/ml或更高，对应单批次生产则可以获得更多的产出，但更高的细胞密度意味着对于细胞培养条件要求更高，需要有更稳定且充分的营养成分来支持细胞高密度的生长和高蛋白量的产出。

4、根据2011年的中国医药生物技术协会出版的《细胞培养基标准及检测方法》，检测细胞培养基质量标准的检测项目有，澄清度、ph值、渗透压、干燥减量的质量分数、细菌内毒素、生物限度、细胞生长实验、牛血清白蛋白和抗生素，这些检项均按照中国药典和中国行业标准《哺乳动物细胞培养基》的检测方法为准。由于细胞培养基的组分相当复杂，检测澄清、ph等化学物理性质在并不能完全反映培养基的质量和稳定性。且行业标准中细胞生长实验用的是vero细胞，培养的方式是贴壁培养，要求的标准是细胞形态无异常变异，培养72小时后细胞密度不低于1×105cells/ml，继续培养48小时后，细胞数量不低于1×105cells/ml(此处考察的维持细胞生长的能力)，随着现代生物制药中普遍采用的高细胞密度培养，此方法已经不再适用，一方面是该实验中细胞系较不具有代表性，另一方面实际生产中细胞培养方式为悬浮培养，且细胞密度远高于传统检测方法的要求。

5、培养基供应商提供的培养基的检测证书和《细胞培养基标准及检测方法》中的标准类似。而由于供应商提供的培养基的配方往往涉及专利保护或技术秘密，对于购买培养基的技术人员而言，无法提供具体营养成分的标准，供应商提供的促生长实验也是局限于供应商自己的细胞系，其接受标准也和实际大规模生产对培养基支持的细胞密度要求有一定差距。

6、鉴于上述，本领域中有必要研究针对商业培养基或预制培养基的质量控制方法，来使得基于所述培养基的生产更为稳定和高效，以期减少培养/发酵低生产效率的事件的发生。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种细胞培养基测试方法及其在生物制药中的应用。

2、在本发明的第一方面，提供一种分析培养基质量的方法，包括：(1)分析待测培养基的理化性质，分析其理化性质三指标：ph值、浊度和渗透压；确定符合理化性质三指标的培养基、及不符合理化性质三指标的培养基；(2)对于(1)中获得的符合理化性质三指标的培养基，进行生化四指标和金属元素(微量金属离子)六指标的分析；所述生化四指标为：谷氨酰胺、葡萄糖、钾离子和钠离子；所述金属元素六指标为：钙离子、铜离子、铁离子、镁离子、锰离子和锌离子；确定符合生化四指标、金属元素六指标的培养基，其为合格培养基；确定不符合生化四指标、金属元素六指标的培养基，其为不合格培养基；其中，所述的合格培养基为功能稳定、适于细胞促生长的培养基。

3、在本发明的另一方面，提供一种定向选择功能稳定、适于细胞促生长的培养基的方法，包括：(1’)分析待测培养基的理化性质，分析其理化性质三指标：ph值、浊度和渗透压；选择符合理化性质三指标的培养基；(2’)对于(1’)中获得的符合理化性质三指标的培养基，进行生化四指标和金属元素六指标的分析；所述生化四指标为：谷氨酰胺、葡萄糖、钾离子和钠离子；所述金属元素六指标为：钙离子、铜离子、铁离子、镁离子、锰离子和锌离子；确定符合生化四指标、金属元素六指标的培养基，其为能稳定、适于细胞促生长的培养基。

4、在一种或多种实施方式中，培养基中，所述理化性质三指标符合如下范围：

5、ph：             6.90-7.55；

6、浊度：           ＜4.00ntu；

7、渗透压：         300-340mosm/kg。

8、在一种或多种实施方式中，培养基中，所述生化四指标符合如下范围：

9、

10、在一种或多种实施方式中，培养基中，所述金属元素六指标符合如下范围：

11、

12、在一种或多种实施方式中，使用摇瓶培养和多级种子培养基传代模式进行所述分析或所述定向选择时；较佳地，所述多级种子培养及传代包括：复苏阶段及1-5次(如1-1次、1-2次、1-4次、1-6次、1-7次)的传代；较佳地，所述多级为五级，包括复苏阶段及1-4次的传代；较佳地，所述摇瓶培养包括悬浮震荡形式的摇瓶培养。

13、在本发明的另一方面，提供一种培养细胞或利用所述细胞进行蛋白生产的方法，包括：(a)以前面任一所述的方法定向选择功能稳定、适于细胞促生长的培养基；(b)利用(a)的培养基培养细胞或利用所述细胞进行蛋白生产。

14、在一种或多种实施方式中，所述细胞包括：引入外源基因的细胞(表达/生产蛋白)或未引入外源基因的细胞(进行细胞增殖)。

15、在一种或多种实施方式中，所述的细胞包括：cho细胞；例如，所述细胞为cho-k1细胞系。

16、在一种或多种实施方式中，所述的培养基包括：无动物源成分和/或化学限定的培养基。

17、在一种或多种实施方式中，所述培养基包括：商品化培养基，或实验室预制的培养基。

18、在一种或多种实施方式中，所述培养基包括：cho培养基，如但不限于actipro培养基。

19、在一种或多种实施方式中，以血气分析仪(bga)和/或生化测试仪(cedex)检测培养基生化参数；所述生化参数包括生化四指标。

20、在一种或多种实施方式中，以电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)检测培养基金属元素(微量金属离子)；所述金属元素包括：钙离子、铜离子、铁离子、镁离子、锰离子和锌离子。

21、在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法的应用，用于对培养基进行质量控制；较佳地，对用于细胞培养或蛋白药物生产的培养基进行质量分析，排除不合格培养基，选择合格培养基。

22、在本发明的另一方面，提供一种用于对培养基进行质量控制的系统(如装置)，其包括如下检测单元及数据分析单元：

23、(i)检测单元1和数据分析单元1；所述检测单元1设置有理化性质三指标测定组件(如仪器或装置)，所述理化性质三指标为ph值、浊度和渗透压；所述数据分析单元1包括对检测单元1的测定结果进行分析处理的处理单元，输出理化性质三指标判定结果；

24、(ii)检测单元2和数据分析单元2；所述检测单元2设置有生化四指标测定组件，所述生化四指标为谷氨酰胺、葡萄糖、钾离子和钠离子；所述数据分析单元2包括对检测单元2的测定结果进行分析处理的处理单元，输出生化四指标判定结果；

25、(iii)检测单元3和数据分析单元3；所述检测单元3设置有金属元素六指标测定组件；其中所述金属元素六指标为钙离子、铜离子、铁离子、镁离子、锰离子和锌离子；所述数据分析单元3包括对检测单元3的测定结果进行分析处理的处理单元，输出金属元素六指标判定结果。

26、在一种或多种实施方式中，所述(i)中预设有理化性质三指标范围值，若在范围值内、判定为合格，若在范围值外、判定为不合格：

27、ph：             6.90-7.55；

28、浊度：           ＜4.00ntu；

29、渗透压：         300-340mosm/kg。

30、在一种或多种实施方式中，所述(ii)中预设有生化四指标范围值，若在范围值内、判定为合格，若在范围值外、判定为不合格：

31、

32、在一种或多种实施方式中，所述(iii)中预设有金属元素六指标范围值，若在范围值内、判定为合格，若在范围值外、判定为不合格：

33、

34、在一种或多种实施方式中，当(i)判定为不合格时，不进行(ii)和(iii)；当(i)判定为合格时，进行(ii)和(iii)；当(ii)或(iii)任一判定为不合格时，所述培养基为不合格培养基；当(ii)和(iii)均判定为合格时，所述培养基为合格培养基；

35、在一种或多种实施方式中，所述系统还包括：(iv)数据分析单元4，其用于汇总(i)、(ii)或(iii)的判定结果，输出培养基为不合格培养基或为合格培养基的结论。

36、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。