基于CRISPR-Cas13快速检测痛风ABCG2SNP基因型的试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种自动基于crispr-cas13快速检测痛风abcg2 snp基因型的试剂盒及方法。

背景技术：

1、痛风(gout)是由嘌呤代谢紊乱和肾小管源性的尿酸排泄障碍而引起关节及某些器官损害的一种代谢疾病。高血酸尿症(hyperur icemia，hua)、饮酒、代谢综合征、高血压、肥胖、利尿剂的服用等危险因素都与痛风的发生发展有关。痛风，高尿酸血症患者并发症发生率非常高，例如心血管疾病、2型糖尿病、代谢综合征、慢性肾脏疾病、癌症和过早衰老。目前关于痛风的发病机制尚不清楚，但大量研究表明是痛风是一种由环境和遗传因素共同作用引起的多基因遗传病，目前已知的痛风相关基因有slc2a9、urat1、abcg2等。鉴于痛风对患者引起的严重危害和沉重的负担，对痛风易感基因的筛查和研究日益受到人们的关注。

2、人体内调节尿酸盐的分泌和再吸收是在肾小管和肠道中发生，肾脏排泄约占尿酸盐总排泄量的三分之二，其余三分之一主要通过肠道排泄。执行这类工作的蛋白质称为尿酸盐转运蛋白，其中一些有缺陷的尿酸盐转运蛋白是目前临床使用降尿酸盐药物的治疗靶点。在所有转运蛋白中，abcg2是目前被称为最重要肾脏尿酸盐排泄转运体。

3、abcg2介导的尿酸盐转运受损导致痛风或高尿酸血症，因此，abcg2中的特异性突变和多态性存在遗传风险，这个基因多态与尿酸盐水平和痛风具有相关性，而最新研究发现rs2231142基因多态t/t基因型频率与汉族男性和女性的痛风发生均有显著的相关性。abcg2在机体内具有重要的生理功能，其遗传变异可能具有重要的临床意义。abcg2基因突变后，会导致肾脏处理尿酸的功能异常，导致尿酸排泄能力下降。由于abcg2对药物和外源性物质的外排作用，abcg2基因多态性及abcg2表达和功能的差异可导致不同群体或个体对某些疾病存在不同的易感性，是影响药物耐药及药物个体间差异的重要因素之一，将为临床合理用药提供理论和实践依据。研究人员通过扫描了中国汉族人最小等位基因频率(minimum a l le le frequency,maf)较高的10个位点，提示abcg2可能是中国汉族人群发生痛风性关节炎的一个预测基因，而且携带该突变(t/t基因型)的痛风患者具有发病早、病程早期即表现出频繁发作和多关节受累的临床特点。t等位基因携带者发病风险比正常g等位基因携带者患病风险提高，tg、tt型可能为高风险基因型，携带痛风易感基因位点的可能具有较高的合并糖尿病、高血压、高血糖、三酰甘油等疾病的机率。

4、snp(单核苷酸多态性)在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。有些snp位点还会影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究(如生物的起源、进化及迁移等方面)和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。

5、目前大规模snp基因分型的黄金标准包括snp微阵列，taqman snp基因分型或二代测序方法。尽管这些技术具有高通量优点，但是目前大多数snp分型检测方法都需要先提取样品dna，都需要dna扩增，从而获得足量的含snp位点区域片段进行进一步的检测。目前对snp的检测及与疾病的相关性研究多在相关实验室进行。由于临床样品需要在各临床治疗单位采集，要将这些样品集中到相关实验室，其保存和运输均需要较高的要求如低温等，这无形中增加了snp检测的工作量和成本，目前虽已有直接针对血样进行pcr扩增的技术，但是这些技术多需要电泳检测，对于大样本检测而言工作量依然很大，而且很多凝胶染料如溴化乙啶(eb)等对操作人员有潜在的危害，极大地限制了snp检测分析技术在临床领域的研究与应用，因此也无法大规模推广应用。

6、crispr-cas是新型分子检测技术，主要原理是利用cas蛋白接触并结合靶向片段后，本身的无差别反式切割功能被激活，会切割附近一切核酸序列的特点，通过检测体系中添加探针序列被切割情况从而判断靶向片段是否存在的一种检测方法。

7、张锋等利用cr i spr-cas13a具有“旁路活性”(co l l atera l effect)的特点，即cas13a结合特异性靶标rna后随机切割其他rna(这里设计成rna荧光报告系统)，与等温扩增技术recombinase po lymerase amp l ificat ion(rpa)相结合，把这种检测方法称为sher lock(specific h igh sens it ivity enzymat ic reporter un locking)。该探针信号分子是预先加入的两端分别带有荧光基团和淬灭基团的rna，或寡核苷酸探针两端分别带有荧光基团fam和生物素。rna被剪切后，荧光基团就会发出荧光。当复合体识别切割靶序列之后，可以触发对于非特异性单链的切割活性，检测体系中的单链报告分子被切割，发出荧光，从而确认靶序列(snp)的存在。

8、目前，对abcg2的研究主要集中在对痛风的早期诊断、更安全更有效的治疗方面；而上述基因多态性将可能成为突破点。matsuo等进行基因分型研究发现，abcg2常见的功能障碍是早发性痛风的主要原因，这将有利于痛风早期诊断，提高高危人群的早期预防和治疗比率。目前尚无基于crispr-cas13快速检测痛风abcg2基因型来快速诊断痛风高危位点及作为指导痛风精准化用药依据的报道。

技术实现思路

1、本发明提供一种基于crispr-cas13快速检测痛风abcg2 snp基因型的试剂盒及检测方法，分别设计识别abcg2高危位点rs2231142的g和t snp单核酸多态crrna(向导序列)：负责与待检靶标rna的g或u进行互补配对，形成双链从而激活结合的cas13蛋白，以快速诊断痛风高危位点。

2、为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于crispr-cas13快速检测痛风abcg2 snp基因型的试剂盒，包括用于特异扩增abcg2基因rs2231142(snp)的引物，向导rna、cas蛋白、缓冲液和荧光报告分子fam-ssrna-biot in，所述引物序列为：

3、上游引物5’-gaaattaatacgactcactataggg ggaaagtcct acttatgctgatcatgatgc-3’；

4、下游引物5’-gttatgtatactaaacagtcatggtcttag-3’；

5、向导rna包括crrnag和crrnat，其序列分别为

6、5’-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacuacacuucucagcagcucuucggcuugc-3’、

7、5’-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacuaaacuucucagcagcucuucggcuugc-3’；

8、cas蛋白为cas13a蛋白；

9、缓冲液包括peg、海藻糖、磷酸肌酸二钠盐以及醋酸镁

10、荧光报告分子fam-ssrna-biot in序列为5’-fam-uuuuuuuuuuuuuu-3’biotin。

11、优选的，cas13a蛋白为lwacas13a蛋白。

12、优选的，试剂盒还包括侧向流胶体金试纸条。

13、本发明还涉及一种基于crispr-cas13快速检测痛风abcg2 snp基因型的检测方法，用于检测rs2231142基因型，所述方法包括：将含有待检靶标样品加入到前述试剂盒的反应体系中，试剂盒包括crrnat、cas蛋白、缓冲液和荧光报告分子fam-ssrna-biot in，在所述反应体系中一步完成等温扩增及靶位点信号识别，然后对其进行侧向流双抗原夹心法检测，当检测到abcg2 rs2231142t等位基因时，试纸条显示检测线、质检线，当检测不到abcg2 rs2231142t等位基因时，试纸条显示质检线，从而达到快速筛查出样品中是否携带突变等位基因t，为无症状。

14、优选的，所述样品为唾液或口咽拭子。

15、优选的，所述样品同时加入到含crrnag、cas蛋白、缓冲液和荧光报告分子fam-ssrna-biot in的试剂盒反应体系中，进一步确定基因型，为无症状高尿酸血症患者痛风发病风险的预判，并进行早期干预。

16、优选的，等温扩增的温度为22℃-42℃，扩增的时间为15-40mins。

17、优选的，向导rna是指引导cas蛋白特异性结合靶标rna的rna(crrna)，所述特异性crrna的制备方法包括：针对abcg2基因，寻找包含单核苷酸多态位点序列(g/t)，设计包含此序列的靶向序列，19-30nt长度的crrna，设计完成后，合成o l igo，构建到载体puc57，通过体外转录获得目的crrna。

18、本发明的有益效果：

19、本发明采用上述技术方案，设计识别abcg2高危位点rs2231142的g和t snp单核酸多态crrna，以快速诊断痛风高危位点，摆脱了传统方法对qpcr仪等精密仪器的依赖，通过确定基因型实现对痛风患者个体化精准用药，使得crispr-cas技术在痛风病的基因型诊断方面具有广阔的应用前景。