一株刺梨单宁高效降解菌SL006及其应用

0.5wt％尿素制成的。
14.进一步地，所述辅料包括大豆粉、玉米粉、米糠和麦麸中的一种或多种。
15.进一步地，所述单宁样品包括含有单宁的刺梨果渣。
16.本发明公开了以下技术效果：
17.1.类阿达青霉penicillium adametzioides菌株sl006对单宁的降解率高达98.31％，可作为高效单宁降解工程菌株。
18.2.类阿达青霉penicillium adametzioides菌株sl006在30℃、ph 11时最适于菌丝生长和单宁降解。但满足菌株sl006降解单宁和菌丝生长的营养条件有显著差异，碳源和氮源分别为淀粉和蛋白胨时单宁降解率最高，碳源和氮源分别为葡萄糖和尿素时最适合菌丝生长，在菌株工业运用中可根据培养目的选择合适的碳源和氮源成分。
19.3.菌株sl006直接用于刺梨果渣发酵效率低，在其中加入5％的大豆粉可高效促进菌株sl006对刺梨果渣中单宁的降解，在发酵8d后单宁降解率即达到95.24％。
20.本发明从发霉刺梨渣中分离、纯化和筛选出对单宁具有高效降解能力的类阿达青霉(penicillium adametzioides)sl006。通过实验验证，筛选出的类阿达青霉菌株sl006对单宁降解率高达98.31％，同时通过改善发酵条件和配方，菌株sl006对刺梨果渣内的单宁的降解率达到95％以上，在刺梨果渣的有机肥发酵的品质改善中具有重要意义。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为刺梨果渣单宁降解菌初筛效果；
23.图2为单宁标准曲线；
24.图3为4个菌株的单宁降解效果；
25.图4为类阿达青霉penicillium adametzioides sl006的形态特征；其中a-b为菌落正反面，c-e为帚状分枝，f-i为分生孢子，标尺＝10μm；
26.图5为基于its和β-tubulin多基因序列以极大似然法构建的系统进化树；
27.图6为不同温度(a)、ph值(b)、碳源(c)和氮源(d)对菌株sl006菌丝生长量及单宁降解的影响；
28.图7为菌株sl006对刺梨果渣单宁的降解效果，其中a为各个处理的单宁含量，b为各个处理下的单宁降解率。
具体实施方式
29.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
30.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中
间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
31.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
32.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
33.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
34.实施例1单宁降解菌的分离与初筛
35.(1)1％单宁无菌溶液配制。称取10g单宁溶解于1000ml温热蒸馏水中，用磁力加热搅拌器搅拌30min，使之充分溶解，在超净工作台中用0.22μm无菌微孔滤膜过滤除菌2次后制得1％单宁无菌溶液，避光5℃保藏备用。
36.(2)单宁降解菌筛选培养基的配制。分别称取4.38g kh2po4，8.76g(nh4)2so4，18.00mg mncl2·
6h2o，880.00mg mgso4·
7h2o、88.00mg cacl2，120.00mg feso4·
7h2o，8.80mg namoo4·
2h2o，40.00mg溴酚兰和20.00g琼脂溶解于1000ml蒸馏水中，用1.0mol/l的hcl将其ph调节为5.5，121℃下灭菌15min。灭菌的培养基待冷却至55℃左右加入1％单宁无菌溶液10ml，混匀后倒入9cm培养皿制得筛选平板。
37.(3)单宁降解菌的分离与初筛。选取发霉刺梨果渣块，以三点法将组织小块接种于pda培养基中，25℃培养24h～48h后切取菌落边缘，连续纯化得到纯菌株备用。纯化菌株用6mm打孔器打取菌落边缘小菌饼以单点法接种在单宁降解菌筛选培养基平板中央，置于25℃、黑暗条件下培养6d后观察和测量菌落周围透明圈透明程度和宽度(mm)来衡量菌株单宁分解能力。
38.从发霉的刺梨果渣内共分离出26株真菌菌株，但只有sl002、sl003-1、sl004和sl0064株菌株菌落周围具有透明晕圈(图1)，其中以株菌sl006的降解晕圈最明显，直径也最大，说明株菌sl006的单宁降解能力最强。
39.实施例2单宁降解菌的复筛
40.(1)0.1％单宁标准液配制。精确称取单宁标准品0.250g溶解于200ml的温热蒸馏水中，用磁力搅拌器充分搅拌30min，再用250ml容量瓶定容，用0.22μm微孔滤膜过滤除去不容颗粒物后即制得0.1％的单宁标准液，避光5℃保藏备用。
41.(2)fecl3显色剂的配制。称取0.162g的fecl3溶解于100ml 0.01mol/l的hcl中，避光5℃保藏备用。
42.(3)单宁标准曲线的制作。分别吸取0.00、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1ml的0.1％单宁标准液加入6支洁净试管，再快速依次加入6ml fecl3显色剂，室温下反应30min后用分光光度计读取530nm处吸光度值，最终以单宁体积(v)为横坐标，吸光值(a
530
)为纵坐标构建单宁标准曲线。设置3次重复。
43.(4)单宁pd液体培养基配制。称取200g马铃薯加入1l水中煮沸30min，过滤后在滤液中加入20g葡萄糖，加水补至1000ml得到pd液体培养基。将pd液体培养基量取90ml装入250ml锥型瓶内，于121℃灭菌锅内灭菌15min，待pd液冷却后加入1％无菌单宁溶液10ml，充分混合后备用。
44.(5)单宁降解菌的复筛。将初筛得到的菌株用pda平板活化后打取3块6mm小菌饼接入100ml单宁的pd液体培养基中，170r/min，25℃下震荡培养，6d后对发酵产物进行双层纱布过滤和10000r/min、5min高速离心，取0.1ml上清液滴入6ml的fecl3显色剂中，在室温下反应30min后用分光光度计读取530nm处吸光值；以加入0.1ml去离子水作为对照，设置3次重复。将测得的吸光值带入标准曲线计算其含量，最终算出单宁降解率(％)：单宁降解率(％)＝(对照发酵液单宁平均含量-菌株发酵液单宁平均含量)
×
100/对照发酵液单宁平均含量。
45.通过fecl3显色法构建的单宁标准曲线如图2所示，在设置的浓度梯度范围内，随着单宁含量的升高，反应体系在530nm下的吸光值越大，线性回归方程为y＝6.2129x+0.0802，r2值达到了0.9921，线性达到要求。
46.初筛中的4个菌株对单宁降解能力如图3所示，4株菌降解能力差异达到显著水平，4株菌在单宁pd液体培养基中培养6d后，菌株sl006降解率高达98.31％，单宁降解效果非常理想。
47.实施例3单宁降解菌株sl006的形态鉴定
48.用无菌接种针挑取菌株菌丝以单点法接种于pda平板中央，25℃、自然光照中培养7d后观察菌落正反面颜色并用十字交叉法测量菌落直径；再用插片培养法培养菌株，于奥林巴斯bx53显微成像系统中观察、测量菌株形态结构。
49.菌株sl006的形态特征如图4所示。在pda上25℃培养7d后菌落直径26～33mm(29.25
±
3.04mm,n＝6)，有轮纹，中心略凸起，质地紧密，较薄，正面浅青色，背面颜色呈橙黄色，中心颜色较深(图4中a-b)。分生孢子梗发生于气生菌丝顶端，帚状分枝单轮生，瓶梗安瓿瓶状，每轮3～8个甚至更多，大小为7.92～12.54
×
2.27～3.44μm(`x＝10.55
±
1.27
×
2.78
±
0.31μm,n＝30)(图4中c-e)；分生孢子在瓶梗顶端串生成链状，椭圆形或圆形，大小2.15～3.91
×
1.71～2.61μm(`x＝2.82
±
0.36
×
2.24
±
0.21μm,n＝30)，表面光滑(图4中f-i)，具有类阿达青霉penicillium adametzioides的典型形态特征。
50.实施例4单宁降解菌株sl006的分子鉴定
51.将供试菌株接种于pda平板培养基上，置于25℃恒温培养10d后刮取菌丝，用改良的ctab法提取菌株dna(改良的ctab法参考张颖慧,魏东盛,邢来君,等.一种改进的丝状真菌dna提取方法[j].微生物学通报,2008,no.199(03):466-469.)。扩增的目的序列分别为β-微管蛋白基因(tub2)和内部转录间隔区(its)。
[0052]
β-tubulin基因选用引物：
[0053]
bt2a：5
′‑
ggtaaccaaatcggtgctgctttc-3
′
；
[0054]
bt2b：5
′‑
accctcagtgtagtgacccttggc-3
′
。
[0055]
its序列的引物选用引物：
[0056]
its1：5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
；
[0057]
its4：5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
。
[0058]
pcr反应体系(25μl)：正向引物1μl，反向引物1μl，2
×
taq pcr mas-ter mix
×
12.5μl，ddh2o 8.5μl，模板2μl。
[0059]
扩增β-tubulin的pcr反应条件：95℃预变性4min；94℃变性48s；55℃退火48s；72℃延伸60s；35个循环；72℃延伸5min；扩增its的pcr反应条件：94℃预变性3min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸60s；35个循环；最后72℃延伸5min。
[0060]
扩增完毕后，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，由北京擎科生物技术有限公司进行纯化和测序。将所得序列输入genbank的blast中进行同源序列检索，查找相似性较高的菌株。2个基因序列用sequence matrix 1.7.8进行拼接，拼接结果用mega 11软件以极大似然法(maximum likelihood method,ml)构建系统发育树，确定菌株的分类地位。
[0061]
β-tubulin基因序列：
[0062]
ctgctttctggtacgtgtttccacccatcaaatgttgacacccattgaaacttttttactaactaccttataggcagaacattgcctccgagcacggtctcgatggtgatggacagtaagttctttgattcgagtcgattggtatatatggtgggaatggcggtctgatattttttttctagcttcaccggccagtccgacctccagctggagcgtatgaacgtctacttcaaccacgtaagtgtggaattgatccctcgagccattcgatattggctaatatttggattgtttacaggccagcggtgaccgttacgttccccgtgccgtcctggtcgatttggagcccggtaccatggacgctgtccgtgccggtcctttcggcaagcttttccgtcccgacaacttcgttttcggtcagtccggtgctggtaacaactgggccaagggt。
[0063]
菌株its序列：
[0064]
cattactgagtgagggccttcgggtccaacctcccacccgtgtctattgtaccatgttgcttcggcaggcccgccttatggccgccgggggctaaccgccccgggcccgcgcctgccgaagacccctctgaacgctgtctgaagattgccgtctgagcgaaacatataaattatttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccctctggtattccggagggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggtctcgtcccccccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgtgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctctgtaggcccggccggcgcctgtcgacccccaatctatttttttcaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatat。
[0065]
根据菌株sl006的its和β-tubulin序列，从genbank中下载17个同源性较高的序列，以penicillium implicatum nrrl 2061作为外类群，用mega 11构建ml系统发育树(图5)。菌株sl006与类阿达青霉penicillium adametzioides以100％的高支持率聚为一支。因此，基于形态学及its和β-tubulin序列分析，将菌株sl006鉴定为类阿达青霉penicillium adametzioides。
[0066]
菌株sl006的保藏
[0067]
菌株sl006的分类命名为类阿达青霉penicillium adametzioides，已于2022年12月13日保藏于中国典型微生物保藏管理中心(简称cctcc，地址为：中国武汉大学)，保藏编号：cctcc no：m 20221946。
[0068]
实施例5单宁降解菌sl006的发酵条件筛选
[0069]
(1)菌株种子液制备。在100ml察氏液体培养基中接种3块6mm菌株小菌饼，在25℃、160r/min的摇床中震荡培养48h后制得种子液备用。
[0070]
(2)温度对单宁降解菌sl006生长及单宁降解的影响。在100ml含0.1％的单宁的液
体察氏液体培养基中接种2ml种子液后分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的160r/min摇床中培养，5d后测量各个温度处理下的单宁降解菌菌丝生长量(g)及液体培养基中单宁的含量。设置3次重复。菌丝生长量(mg)的测定：将纱布裁剪成10
×
10cm小方块，放入烘箱中烘至恒重后称量纱布干重(mg)；将培养后的生防菌菌液倒在3层已知重量的纱布上进行过滤，收集菌丝和纱布一起放在60℃下烘干至恒重并称量总干重(mg)。菌丝生长量(mg)＝纱布和菌丝总干重-纱布干重。液体培养基中单宁的含量测定同实施例2。
[0071]
(3)不同ph对菌株菌丝生长量及单宁降解的影响。先用1mol/ml的hcl或naoh分别将含0.1％单宁的液体察氏培养基ph值调整为5、6、7、8、9、10、11、12、13等梯度，在100ml不同ph值培养基中接种2ml种子液，统一置于(2)中得出的最适温度、160r/min摇床中培养，余下步骤同(2)。
[0072]
(4)碳源对菌株菌丝生长量及单宁降解的影响。将含0.1％单宁的液体察氏液体培养基中的蔗糖同质量替换为淀粉、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘油，并将ph值调节至(3)得出的最适ph值。在100ml培养基中接种2ml种子液，统一置于(2)中得出的最适温度、160r/min摇床中培养，余下步骤同(2)。
[0073]
(5)氮源对菌株菌丝生长量及单宁降解的影响。将含0.1％单宁的液体察氏液体培养基中的硝酸钠同质量替换为尿素、蛋白胨、硝酸铵、酵母粉，并将ph值调节至(3)得出的最适ph值。在100ml培养基中接种2ml种子液，统一置于(2)中得出的最适温度、160r/min摇床中培养，余下步骤同(2)。
[0074]
不同温度、ph值、碳源和氮源处理对菌株sl006的单宁降解率和菌丝生长的影响达到显著水平(图6)。菌株sl006在30℃培养下其单宁降解率和菌丝生长量均显著高于其他温度处理(图6中a)；在ph值为7～11时菌株单宁降解率最高，在ph 11时菌株菌丝生长量最大(图6中b)。说明菌株sl006在30℃、ph 11时最适于菌丝生长和单宁降解。
[0075]
以淀粉为碳源培养下单宁降解率显著高于其他处理，其次是麦芽糖和葡萄糖，蔗糖和果糖最差；以葡萄糖为碳源处理菌丝生长量显著高于其他处理，其次是蔗糖，淀粉、麦芽糖和果糖效果最差(图6中c)。在以蛋白胨为氮源培养下其单宁降解率显著高于其他氮源处理，尿素为氮源处理下菌丝生长量最高(图6中d)。说明满足菌株sl006降解单宁和菌丝生长的营养条件有显著差异，碳源和氮源分别为淀粉和蛋白胨时单宁降解率最高，碳源和氮源分别为葡萄糖和尿素时最适合菌丝生长，在菌株工业运用中可根据培养目的选择合适的碳源和氮源成分。
[0076]
实施例6单宁降解菌对刺梨果渣中单宁降解特性研究
[0077]
(1)刺梨果渣固体培养基配制和降解菌接种。将新鲜刺梨果渣于50℃下烘干至恒重，并用陶瓷研钵将果渣研细，过40目尼龙筛；分别在刺梨果渣中分别加入5％的细度为40目的麦麸粉、玉米粉、大豆粉和0.3％尿素，以纯刺梨果渣为对照，加入5ml去离子水充分搅拌均匀，并调节ph值至实施例5得出的最适ph值，置于9mm培养皿中于121℃下灭菌5min。冷却后每皿分别接入0.5ml单宁降解菌的种子液。每个处理接10皿，重复3次。充分搅拌均匀后将果渣压平整，盖上保鲜膜后置于实施例5得出的最适温度中进行培养，并每隔2d抽样测量1次果渣中单宁含量，直至第10d。
[0078]
(2)刺梨果渣中单宁含量测定。将经发酵的果渣于50℃下烘干至恒重，用陶瓷研钵研磨并过100目尼龙筛。精确称取1.00g果渣粉末倒入三角瓶中，加入25ml 20％乙醇溶液，
在25℃、160r/min中震荡提取120min。提取液于8000r/min下离心5min后，取0.1ml上清液滴入6ml的fecl3显色剂中，在室温下反应30min后用分光光度计读取530nm处吸光值。各处理提取液中的单宁含量(％)测定方法同实施例2。单宁降解率(％)＝(各处理0d单宁含量-各处理i天单宁平均含量)
×
100/各处理0d单宁含量。
[0079]
菌株sl006对刺梨果渣内的单宁降解效果明显(图7中a-b)。发酵达到第8d时单宁含量基本稳定。单一刺梨果渣发酵在第8d时降解率仅为54.24％；在刺梨果渣中添加5％大豆粉、玉米粉、米糠和麦麸等均能显著提高菌株sl006的单宁降解率，其中以添加5％大豆粉处理的单宁降解率最高，在发酵8d时其单宁降解率即达到95.24％。说明菌株sl006直接用于刺梨果渣发酵效率低，在其中加入含氮较高的大豆粉可高效促进菌株sl006对刺梨果渣中单宁的降解。
[0080]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。