包虫病检测引物、探针、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学检测，尤其涉及一种包虫病检测引物、探针、试剂盒及应用。

背景技术：

1、包虫病(hydatidosis)又称棘球蚴病(echinococcosis)。该病不仅是传播最广泛的寄生虫病之一，也是公共卫生方面治疗和预防费用最高的疾病之一，呈地方性流行，是由棘球属的绦虫的幼虫寄生于人或动物机体组织所引发的传染病。包虫病的早期临床表现无自觉症状，全身健康状况良好，病程进展缓慢，潜伏期1-30年。在分类学上可以分为四个虫种:细粒棘球绦虫(echinococcus granulosus，eg)、多房棘球绦虫(echinococcusmultilocularis，em)、伏氏棘球绦虫(echinococcus vogeli，ev)和少节棘球绦虫(echinococcus oligarthrus，eo)。这四种棘球属绦虫可引起不同类型的包虫病。包虫病有“虫癌”之称。该病直接导致器官或屠体死亡，间接影响人和动物的健康。采取早期诊断、早期治疗以及积极防治动物传染源的综合性防治措施，对控制包虫病对人类健康和畜牧业发展的影响十分重要。

2、包虫病的诊断目前主要依靠于b超、影像学检查和病理学检查等。因方法自身限制，易造成小病灶、非典型病灶的误诊和漏诊。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的包虫检测方法。随着分子生物学技术的发展，近年来出现了一系列检测包虫病的新方法，如多重pcr检测法、粪抗原elisa法、粪dna检测方法等。目前这些检测方法，均是针对细粒棘球绦虫或者多房棘球绦虫单独设计的引物和探针，增加了检测成本；多重pcr因其在一个反应体系中加入了二对以上的引物，容易与亲缘关系较近的病原发生交叉反应，并且引物对之间也易发生互补结合、易产生干扰反应现象，因此，存在特异性差问题。elisa方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低。

3、目前在包虫病检测方面已开发了多种pcr检测方法，trachsel,d.等开发了一种多重pcr来区分多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和带绦虫的感染；shang等开发了多重pcr检测方法，用于3种棘球绦虫的特异性和敏感性检测。目前尚未发现能在一个反应管条件下，同时针对细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫四个致病虫种，进行有效检测的技术方案。

技术实现思路

1、有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的一个目的在于提供一种能同时用于检测和鉴定4种包虫病病原的产品，能够快速、有效地进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种包虫病检测引物，包括上游引物hy-f和下游引物hy-r；

3、所述上游引物hy-f的核苷酸序列包括seq id no.1，或，seq idno.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与seq id no.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；

4、所述下游引物hy-r的核苷酸序列包括seq id no.2，或，seq idno.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与seq id no.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

5、本发明还提供了与所述引物配套使用的探针，包括探针hy-p；所述探针hy-p的核苷酸序列包括seq id no.3，或，seq id no.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与seqidno.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

6、本发明还提供了一种包虫病检测试剂盒，所述试剂盒包括所述引物，和/或，所述探针。

7、优选的，所述试剂盒还包括dna聚合酶、缓冲液、dntp、双蒸水中的至少一种。

8、优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

9、本发明还提供了所述引物，或者所述探针，或者所述试剂盒在非疾病诊断目的的棘球绦虫检测中的应用。

10、优选的，所述棘球绦虫的dna中含有目的片段，所述目的片段的核苷酸序列包括seq id no.4，或，seq id no.4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与seq id no.4所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

11、优选的，所述棘球绦虫包括多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫、少节棘球绦虫、细粒棘球绦虫中的至少一种。

12、优选的，所述应用包括如下步骤：

13、s1、提取样品dna；

14、s2、以步骤s1所述样品dna为模板，利用所述引物进行pcr扩增反应；

15、s3、分析pcr产物。

16、优选的，所述非疾病诊断目的的棘球绦虫检测包括如下任意一种：

17、(1)检测食品中是否含有棘球绦虫；

18、(2)检测工作环境中是否含有棘球绦虫。

19、有益效果：

20、本发明提供了一种包虫病检测引物，包括上游引物hy-f和下游引物hy-r；所述上游引物hy-f和下游引物hy-r是根据细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫(genbank accession分别为：nc_008075、nc_000928、nc_009461和nc_009462)的rrns基因序列设计得到，能分别检测细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫中的任何一种包虫病病原，也可同时用于检测和鉴定4种包虫病病原的混合感染。将所述检测引物应用于包虫病的荧光定量pcr检测，能够灵敏地检测包虫病，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，检测结果快速、有效。

技术特征：

1.包虫病检测引物，其特征在于，包括上游引物hy-f和下游引物hy-r；

2.与权利要求1所述引物配套使用的探针，其特征在于，包括探针hy-p；所述探针hy-p的核苷酸序列包括seq id no.3，或，seq id no.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与seq id no.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

3.包虫病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物，和/或，权利要求2所述探针。

4.根据权利要求3所述包虫病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dna聚合酶、缓冲液、dntp、双蒸水中的至少一种。

5.根据权利要求3或4所述包虫病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

6.权利要求1所述引物，或者权利要求2所述探针，或者权利要求3-5任意一项所述试剂盒在非疾病诊断目的的棘球绦虫检测中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述棘球绦虫的dna中含有目的片段，所述目的片段的核苷酸序列包括seq id no.4，或，seq id no.4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能的编码核苷酸序列；或，在严格条件下可以与seq id no.4所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述棘球绦虫包括多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫、少节棘球绦虫、细粒棘球绦虫中的至少一种。

9.根据权利要求6-8任意一项所述应用，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求6-8任意一项所述应用，其特征在于，所述非疾病诊断目的的棘球绦虫检测包括如下任意一种：

技术总结
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种包虫病检测引物、探针、试剂盒及应用。所述包虫病检测引物包括上游引物Hy‑F和下游引物Hy‑R；所述上游引物Hy‑F和下游引物Hy‑R是根据细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、伏氏棘球绦虫和少节棘球绦虫的rrnS基因序列设计得到。将所述检测引物应用于包虫病的荧光定量PCR检测，能够灵敏地检测包虫病，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，检测结果快速、有效。

技术研发人员：孙晓明,高姗姗,经珍珠,王新杰,张阿敏,张棕瑶
受保护的技术使用者：北京亿森宝生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13