一种检测猪多种皮肤病原探针引物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种检测猪多种皮肤病原探针引物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、近年来，随着我国畜牧业的迅速发展，猪皮肤病逐渐成为影响养猪业发展的一类重大疾病。皮肤病会导致猪食欲减退、精神萎顿、被毛松乱、怕冷嗜睡，严重影响猪群的生产性能。

2、猪疥螨病俗称“猪癞”，是由猪疥螨寄生于表皮内而引起的一种接触性传染性寄生虫病；营养不良、管理不善、卫生差的猪群更易发病。严重的疥螨病不但影响增重率及料肉比，而且造成猪只应激剧烈甚至死亡。病猪以剧烈瘙痒为特征，患畜会到处摩擦或以蹄挠其患部使皮肤变红，擦破出血，患部脱毛、结痂，表皮过度增厚角质化，病猪食欲减退、生长停滞、逐渐消瘦甚至衰弱死亡。

3、猪真菌性皮肤病的主要病原为细小孢子菌和须毛藓菌，养殖场的环境潮湿、阴暗则易发病，真菌侵害皮肤、毛发角质，猪只全身形成手掌大小的藓斑，病猪有剧烈的瘙痒感，结痂，在痂块之间产生灰棕色或微黑色连成一片的皮屑覆盖物。

4、猪细菌性皮肤病的主要病原为金黄色葡萄球菌和链球菌，猪形成点状到块状痂皮，严重的全身结痂，颜色为橙色到黑色，脱屑、瘙痒，病猪的全身像长癞一样，严重的皮肤上会出现溃烂，脱皮，皮肤有硬块。

5、真菌、细菌及疥螨引起的皮肤病症状相似，难以区分，目前主要采用的鉴别手段为镜检，但真菌性与细菌性病原在镜下难以确诊，而疥螨由于镜检所能检测的样本量较小，也容易造成误诊。然而，目前尚没有能够快速检测这五种皮肤病原的商品化检测试剂盒，因此急需研制符合当前疫情流行趋势，且能够快速高效检测鉴别上述五种病原的荧光定量pcr商品化试剂盒。

技术实现思路

1、猪疥螨、须毛藓菌、细小孢子菌、猪葡萄球菌、链球菌的基因组在100000-2000000bp，基因组庞大且相关的研究较少。本发明通过毒力蛋白基因的同源性比对，选择保守的基因序列进行探针引物的设计；根据基因序列分析，本发明分别选取猪疥螨ccox1基因、须毛藓菌tef1α基因、细小孢子菌β-tublin基因、猪葡萄球菌sece基因、链球菌ghd基因的保守区域设计荧光探针引物组。本发明第一个目的在于提供一种引物组合在检测猪皮肤病原中的应用；本发明第二个目的在于提供一种探针组合在检测猪皮肤病原中的应用；本发明第三个目的在于提供一种猪皮肤病原的检测试剂；本发明第四个目的在于提供一种猪皮肤病原的检测试剂盒。本发明具体采用如下技术方案：

2、本发明提供了一种检测猪多种皮肤病原引物组合，

3、包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq idno.2所示的下游引物的引物对；

4、包括核苷酸序列如seq id no.4所示的上游引物和核苷酸序列如seq idno.5所示的下游引物的引物对；

5、包括核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物和核苷酸序列如seq idno.8所示的下游引物的引物对；

6、包括核苷酸序列如seq id no.10所示的上游引物和核苷酸序列如seq idno.11所示的下游引物的引物对；

7、包括核苷酸序列如seq id no.13所示的上游引物和核苷酸序列如seq idno.14所示的下游引物的引物对。

8、作为优选，所述引物组合包括猪疥螨检测引物、须毛藓菌检测引物、细小孢子菌检测引物、葡萄球菌检测引物、链球菌检测引物。

9、本发明还提供了一种检测猪多种皮肤病原探针组合，

10、包括：核苷酸序列如seq id no.3所示的检测荧光探针、核苷酸序列如seq idno.6所示的检测荧光探针、核苷酸序列如seq id no.9所示的检测荧光探针、核苷酸序列如seq id no.12所示的检测荧光探针、核苷酸序列如seq idno.15所示的检测荧光探针。

11、作为优选，所述探针组合包括核苷酸序列如seq id no.3所示的猪疥螨ccox1基因检测荧光探针、核苷酸序列如seq id no.6所示的须毛藓菌tef1α基因检测荧光探针、核苷酸序列如seq id no.9所示的细小孢子菌β-tublin基因检测荧光探针、核苷酸序列如seqid no.12所示的猪葡萄球菌sece基因检测荧光探针、核苷酸序列如seq id no.15所示的链球菌ghd基因检测荧光探针。

12、作为优选，所述猪疥螨ccox1基因检测荧光探针的5’端连接有荧光报告基团fam；所述须毛藓菌tef1α基因检测荧光探针的5’端连接有荧光报告基团hex；所述细小孢子菌β-tublin基因检测荧光探针的5’端连接有荧光报告基团cy5；所述猪葡萄球菌sece基因检测荧光探针的5’端连接有荧光报告基团rox；所述链球菌ghd基因检测荧光探针的5’端连接有荧光报告基团cy3。

13、作为优选，所述猪疥螨ccox1基因检测荧光探针、须毛藓菌tef1α基因检测荧光探针的3’端均连接有荧光淬灭基团bhq1；所述细小孢子菌β-tublin基因检测荧光探针、猪葡萄球菌sece基因检测荧光探针、链球菌ghd基因检测荧光探针的3’端均连接有荧光淬灭基团bhq2。

14、本发明还提供了上述引物组合，或上述探针组合在检测猪皮肤病原中的应用；所述猪皮肤病原包括猪疥螨、须毛藓菌、细小孢子菌、猪葡萄球菌、链球菌。

15、本发明还提供了一种猪皮肤病原的检测试剂，所述猪皮肤病原包括猪疥螨、须毛藓菌、细小孢子菌、猪葡萄球菌、链球菌，所述检测试剂包括上述引物组合和/或上述探针组合。

16、本发明还提供了一种猪皮肤病原的检测试剂盒，包括上述检测试剂；还包括阳性对照、阴性对照、pcr扩增液。

17、作为优选，所述阳性对照包括含有猪疥螨、须毛藓菌、细小孢子菌、猪葡萄球菌、链球菌目的基因片段的重组质粒；所述阴性对照包括双蒸水；所述pcr扩增液包括2×animaldetection probe master mix(诺唯赞)。

18、作为优选，引物预混液初始浓度为10μm的疥螨上、下游引物、须毛藓菌上、下游引物、细小孢子菌上、下游引物、葡萄球菌上、下游引物、链球菌上、下游引物摩尔比为1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的预混液；探针预混液初始浓度为10μm的疥螨荧光探针、须毛藓菌荧光探针、细小孢子菌荧光探针、葡萄球菌荧光探针、链球菌荧光探针摩尔比为1:1:1:1:1的预混液。

19、五重荧光定量实验是在一个反应管中同时扩增5个靶标基因进行定量实验，因此5个靶标基因的扩增势必会互相影响，所以要通过引物设计以及反应条件的优化来同步扩增效率，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。由于猪疥螨、须毛藓菌、细小孢子菌、葡萄球菌、链球菌是五种不同的病原，分别为寄生虫、真菌以及细菌，根据具体感染情况，共感染的样本中五种病原浓度可能存在不同程度的差异，在同一反应管中扩增时，如果出现一种病毒基因扩增效率过高，那么其他病毒基因的扩增可能受到抑制，最终影响病原的检出率。本发明通过引物和探针的设计，在五种病原的高度保守的序列中各设计三对探针引物，通过实验匹配灵敏度较高且扩增效率接近的探针引物进行多重荧光定量pcr实验，过程较困难且结果不易控制，需要进行多次实验。同时通过调整引物与荧光探针的比例，优化反应条件，使样本中五种病原基因的扩增效率一致，并且与每个单重反应的灵敏度一致。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、本发明的特异性较强，对于沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、副猪嗜血杆菌，均无非特异性扩增曲线，能够保证检测的准确性。

22、本发明可以同时进行大批量的样本分析，在一次检测操作后，即可鉴别样本中是否含有猪疥螨、须毛藓菌、细小孢子菌、葡萄球菌、链球菌这五种国内流行的导致猪群皮肤病的寄生病原，具有灵敏性高、特异性强、重复性好的特点。