一种5-氨基乙酰丙酸高产菌的高通量筛选系统、方法及其应用

本发明属于合成生物学及微生物代谢工程，具体涉及一种5-氨基乙酰丙酸高产菌的高通量筛选系统、方法及其应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、5-氨基乙酰丙酸(ala)是一种非蛋白质氨基酸，是合成四吡咯化合物(包括血红素、卟啉、叶绿素和维生素b12)的必要前体，这些化合物在维持机体正常生理功能方面发挥着关键作用。由于其安全性、环境兼容性和生物降解性，ala在农业、畜牧业和医药领域有着广泛的应用。如今，通过微生物发酵生产ala是一种环境友好、简单、廉价和可持续的方法，它避免了化学合成中复杂的反应步骤、高成本和环境污染的缺点。

3、ala的生物合成途径广泛存在于植物、动物和微生物中，其生物合成途径分为c4(shemin)途径和c5途径。在c4途径中，通过ala合成酶使琥珀酰辅酶a和甘氨酸一步缩合产生ala。在c5途径中，谷氨酸经历谷氨酰trna合成酶、谷氨酰trna还原酶和谷氨酸-1-半醛转氨酶的三个顺序酶促反应，生成ala，这与c4途径相比更复杂。到目前为止，酶筛选、途径工程、发酵过程优化和耐受性工程都已得到研究，ala的微生物产量也得到了显著提高。在蛋白质工程方面，kang等人通过修改亚利桑那沙门氏菌的谷氨酰trna还原酶(hema)的n-末端氨基酸序列，显著提高了大肠杆菌c5途径的ala产量。tan等人通过计算机辅助蛋白质合理设计降低了沼泽红假单胞菌ala合成酶的血红素抑制，微生物发酵中ala的产量高于野生型。这表明ala生产途径酶的蛋白质工程是提高ala微生物产量的有效策略。然而，发明人发现，关于ala生产通路酶的高通量筛选方法的报道仍然很少。因此，缺乏高通量筛选ala产生途径酶的优良突变体的方法因此成为微生物中高ala产生的限制因素。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸高产菌的高通量筛选系统、方法及其应用。本发明成功构建具有不同动力学范围的camp响应启动子，并在此基础上建立了ala高产菌株的高通量筛选系统，通过荧光激活细胞分选(facs)筛选两条ala生产途径(c4途径和c5途径)中的酶高产突变体，并筛选出ala生产途径酶的优秀突变体菌株。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、具体的，本发明涉及以下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供一种5-氨基乙酰丙酸高产菌的高通量筛选系统，所述高通量筛选系统至少包括对5-氨基乙酰丙酸响应的camp、camp受体蛋白(crp)、以及受crp调控的启动子和报告基因，其中，所述报告基因位于启动子的下游并受到所述启动子的调控。

4、所述启动子包括但不限于pcspe、pepd、pglpd、pgntk、pcspp、pcdd、pmglb、pgapa、pgals和pgalp；经试验证明，上述启动子与camp以及ala等具有良好的剂量-反应关系。

5、本发明的第二个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体携带上述高通量筛选系统。

6、本发明的第三个方面，提供一种细胞，所述细胞包含上述重组表达载体或携带上述高通量筛选系统。

7、所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。

8、本发明的第四个方面，提供上述高通量筛选系统、重组表达载体或细胞在高通量筛选代谢生产5-氨基乙酰丙酸或其上下游产物的菌株中的应用。

9、本发明的第五个方面，提供一种高通量筛选高产5-氨基乙酰丙酸菌株的方法，所述方法包括基于上述高通量筛选系统、重组表达载体或细胞，采用荧光激活细胞分选(facs)筛选高产5-氨基乙酰丙酸菌株。

10、其中，所述高产5-氨基乙酰丙酸菌株，其可以为大肠杆菌及其衍生菌，其具有5-氨基乙酰丙酸c4生产途径相关酶或5-氨基乙酰丙酸c5生产途径相关酶；

11、当所述菌株具有5-氨基乙酰丙酸c4生产途径相关酶时，其具有谷氨酰trna还原酶(hema)突变体，所述hema突变体是由野生型hema在下组中的一个或多个位点发生突变获得：v69a、p91t、v391a、r97h、t317i、v173m、v228i、g152r、a290g、v266i、r292h、a223t、v322l、d379g，所述野生型hema来源于沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustriskugb306)。

12、当所述菌株具有5-氨基乙酰丙酸c5生产途径相关酶时，其具有hema突变体和/或heml突变体；

13、所述hema突变体是由野生型hema在下组中的一个或多个位点发生突变获得：e265v、l112m、d381g、f127y、a164t、i233m、q371r、r272h、k125q、d226v、v302i，所述野生型hema来源于鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)；

14、所述heml突变体是由野生型heml在下组中的一个或多个位点发生突变获得：v203a、v206l、m62i、n67h、a338s、v47i、a157t、t241s、m385l、a304r、e389k、k425g、a70p、p395s、a406g，所述野生型heml来源于大肠杆菌(escherichia coli mg1655)。

15、以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

16、上述技术方案通过研究发现，ala以剂量依赖性的方式导致更高水平的氧化应激，而ala引起的氧化应激降低了大肠杆菌的细胞内camp水平。基于此，上述技术方案构建具有不同动力学范围的camp响应启动子，并在此基础上建立了ala高产菌株的高通量筛选系统。本发明使用该系统通过荧光激活细胞分选(facs)筛选两条ala生产途径(c4途径和c5途径)中的酶高产突变体，并成功地筛选出了ala生产途径酶的优秀突变体菌株，因此具有可观的应用价值和前景。

技术特征：

1.一种5-氨基乙酰丙酸高产菌的高通量筛选系统，其特征在于，所述高通量筛选系统至少包括对5-氨基乙酰丙酸响应的camp、camp受体蛋白crp、以及受crp调控的启动子和报告基因，其中，所述报告基因位于启动子的下游并受到所述启动子的调控。

2.如权利要求1所述的高通量筛选系统，其特征在于，所述报告基因包括编码荧光蛋白的基因；进一步的，所述荧光蛋白为gfp。

3.如权利要求1所述的高通量筛选系统，其特征在于，所述启动子包括pcspe、pepd、pglpd、pgntk、pcspp、pcdd、pmglb、pgapa、pgals和pgalp。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体携带权利要求1-3任一项所述高通量筛选系统。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求4所述重组表达载体或携带权利要求1-3任一项所述高通量筛选系统。

6.如权利要求5所述细胞，其特征在于，所述细胞为原核细胞或真核细胞，进一步的，所述原核细胞为产5-氨基乙酰丙酸的细菌，所述细菌为大肠杆菌及其衍生菌。

7.权利要求1-3任一项所述高通量筛选系统、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5或6所述细胞在高通量筛选代谢生产5-氨基乙酰丙酸或其上下游产物的菌株中的应用。

8.一种高通量筛选高产5-氨基乙酰丙酸菌株的方法，其特征在于，所述方法包括基于权利要求1-3任一项所述高通量筛选系统、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5或6所述细胞，采用荧光激活细胞分选筛选高产5-氨基乙酰丙酸菌株。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光激活细胞分选具体方法包括采用流式细胞仪根据gfp荧光强度对待筛选菌株进行分选；

10.一株高产5-氨基乙酰丙酸菌株，其特征在于，其为大肠杆菌及其衍生菌，其具有5-氨基乙酰丙酸c4生产途径相关酶或5-氨基乙酰丙酸c5生产途径相关酶；

技术总结
本发明属于合成生物学及微生物代谢工程技术领域，具体涉及一种5‑氨基乙酰丙酸高产菌的高通量筛选系统、方法及其应用。本发明通过研究发现，5‑氨基乙酰丙酸(ALA)以剂量依赖性的方式导致更高水平的氧化应激，而ALA引起的氧化应激降低了大肠杆菌的细胞内cAMP水平。基于此，本发明构建具有不同动力学范围的cAMP响应启动子，并在此基础上建立了ALA高产菌株的高通量筛选系统。本发明使用该系统通过荧光激活细胞分选(FACS)筛选两条ALA生产途径(C4途径和C5途径)中的酶高产突变体，并成功地筛选出了ALA生产途径酶的优秀突变体菌株，因此具有良好的实际应用之价值。

技术研发人员：王倩,祁庆生,王琦
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17