源于黄金芽的多酚氧化酶同工酶、基因、粗酶液及应用

本发明属于茶叶加工，具体涉及一种源于黄金芽的多酚氧化酶同工酶、编码基因、粗酶液及应用。

背景技术：

1、发酵茶是在加工过程中，充分发挥和利用多种酶的生物催化作用，生成不同的生物活性物质及风味物质的茶叶。其中，红茶主要是通过多酚氧化酶及过氧化物酶的作用，由儿茶素类化合物(l-ec、l-ecg、l-egc、l-egcg)产生茶黄素及茶红素类化合物。其中茶黄素类化合物主要为tf、tf2a、tf2b和tf3，其合成方式分别为：(l)-egc+(l)-ec→tf、(l)-egcg+(l)-ec→tf2a、(l)-ecg+(l)-egc→tf2b和(l)-egcg+(l)-ecg→tf3。

2、茶黄素对红茶的色、香、味及品质起着决定性的作用，是红茶汤色“亮”的主要成分，也是汤味强度和鲜爽度的重要成分，同时还是形成茶汤“金圈”的最主要物质。此外，研究表明茶黄素还具有显著的生物活性，如抗癌、抗炎、抗病毒、抗高脂、降糖作用、抗代谢综合征特性、预防骨质疏松和调节神经等功能。因此茶黄素含量的高低是决定红茶品质的关键因素之一。

3、茶黄素的产生从制茶的揉捻阶段持续到发酵阶段。然而茶黄素在成品茶中的含量一般不高，高品质的红茶含量一般也仅为1％左右。如何提高制茶过程中茶黄素的生物合成效率，或者如何采用体外合成的方式获得高产茶黄素对提高红茶等发酵茶的品质以及推动其在医疗保健领域的应用具有重要价值。

4、目前，多酚氧化酶(ppo)和过氧化物酶(pod)被认为是在红茶制造生产中生产茶黄素的关键酶，但仅有少数几种茶树中的多酚氧化酶ppo研究的较为透彻。公开日为2015年4月8日的中国发明专利《茶叶多酚氧化酶同工酶单体ppo1和ppo2及其制备方法》(公开号cn104498448 a)采用一芽二叶的政和大白、福云6号、桃源大叶茶树品种茶树鲜叶，依次通过丙酮粉富集酶蛋白、硫酸铵分级沉淀、强阴离子交换色谱、凝胶介质层析、分子鉴定、酶学性质分析等技术及优化工艺，分离制备了氨基酸序列结构、分子量、等电点、酶学性质明确的两种茶叶多酚氧化酶同工酶单体ppo1和ppo2的制备方法。该专利涉及的ppo1和ppo2并无提供具体碱基序列与蛋白序列，其所给gene id也无法对应到相应的ppo同工酶，其蛋白分子量大小也与本发明序列有较大差异。公开日为2015年5月27日的中国发明专利《一种利用茶多酚氧化酶同工酶ppo1酶促合茶黄素tf的方法》(公开号为cn 104651426a)公布了一种利用茶多酚氧化酶同工酶ppo1开展酶促合成茶黄素tf的方法。该方法是介绍以茶多酚氧化酶同工酶ppo1为酶源，以茶多酚中的儿茶素ec和egc组分为主要反应底物，以一定ph值的缓冲液作为反应体系，经摇床振荡酶促反应以及后续的萃取、离心、浓缩、冷冻干燥等步骤，定向酶促合成单一茶黄素组分tf(theaflavin)的技术及工艺优化。

5、黄金芽(camellia sinensis(l.)o.kuntze cv.huangjinya(hjy cs))茶树品种属于黄色系变异茶树品种，对光敏感，在光照下顶部叶片因叶绿素的合成受到抑制而呈现金黄色。其鲜叶色泽金黄、口感滋味丰富，因为稀有，也被称为“茶中大熊猫”。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术问题，并提供一种源于黄金芽的多酚氧化酶同工酶、核苷酸序列与粗酶液及其应用。

2、本发明所采用的具体技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种源于黄金芽的多酚氧化酶同工酶，所述多酚氧化酶同工酶为hjy-ppo1蛋白或hjy-ppo3蛋白，所述hjy-ppo1蛋白氨基酸序列结构如seq idno.1所示，所述hjy-ppo3蛋白氨基酸序列结构如seq id no.2所示。

4、第二方面，本发明提供了一种编码第一方面所述的多酚氧化酶同工酶的基因，所述基因为用于编码hjy-ppo1蛋白的hjy-ppo1基因或用于编码hjy-ppo3蛋白的hjy-ppo3基因，所述hjy-ppo1基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述hjy-ppo3基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

5、第三方面，本发明提供了一种含有第一方面所述的多酚氧化酶同工酶的粗酶液，所述粗酶液制备方法可采用从黄金芽茶树鲜叶中自然提取；优选的，所述自然提取是采用黄金芽茶树鲜叶经磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液提取、过滤、离心后获得含有所述多酚氧化酶同工酶的粗酶液。

6、第四方面，本发明提供了一种含有第一方面所述的多酚氧化酶同工酶的粗酶液，所述粗酶液通过人工合成制备，人工合成方法是将seq id no.3或seq idno.4所示的核苷酸序列作为目的基因序列导入重组大肠杆菌bl21进行体外表达，随后用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液提取，获得含有所述多酚氧化酶同工酶的粗酶液。

7、第五方面，本发明提供了一种第一方面所述多酚氧化酶同工酶的应用，所述多酚氧化酶用于催化儿茶素类物质合成茶黄素和茶红素。

8、作为上述第五方面的优选，所述儿茶素类物质为儿茶素c、表儿茶素ec、儿茶素没食子酸酯cg、表没食子儿茶素egc、表没食子儿茶素没食子酸酯egcg和表儿茶素没食子酸酯ecg中的一种或多种；所述催化合成方式为：(l)-egc+(l)-ec→tf、(l)-egcg+(l)-ec→tf2a、(l)-ecg+(l)-egc→tf2b、(l)-egcg+(l)-ecg→tf3。

9、作为上述第五方面的优选，所述多酚氧化酶同工酶催化儿茶素类物质合成茶黄素和茶红素的功能在茶叶鲜叶体内或体外完成。

10、第六方面，本发明提供了一种第一方面所述的多酚氧化酶同工酶或第二方面所述的基因在茶树育种中的应用。

11、作为上述第六方面的优选，所述应用为通过培育低表达hjy-ppo1基因或hjy-ppo3基因的茶树品种，从而筛选适宜制作高茶多酚含量的绿茶茶树品系。

12、作为上述第六方面的优选，所述应用为培育高表达hjy-ppo1基因或hjy-ppo3基因的茶树品种，从而筛选适宜制作红茶的茶树品系。

13、本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：

14、(1)本发明提供的hjy-ppo1蛋白或hjy-ppo3蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生；

15、(2)本发明提供的多酚氧化酶同工酶或核苷酸序列可作为指标，通过客观数据设置红茶发酵参数(茶叶加工过程中的温度、湿度、ph、时间等)，得到具有预期茶黄素含量的红茶；或是体外以儿茶素类化合物不同单体或混合物为底物，催化合成得到不同类别的茶黄素。

16、(3)本发明提供的hjy-ppo1蛋白或hjy-ppo3蛋白还可以用于体外高效合成单体茶黄素或筛选优良茶树品种、或调整茶叶中茶黄素类化合物含量、或作为标志物筛选适合制作绿茶的茶树品种和/或适合制作红茶的茶树品种。本发明能有效推进茶叶加工的标准化、自动化和机械化。