一种基于RPA结合CRISPR/Cas12恒温扩增技术核酸检测装置的制作方法

本技术属于分子生物技术和分子诊断医学检测领域，尤其涉及一种即时检验poct(point-of-care testing)装置，具体涉及一种基于rpa结合crispr/cas 12恒温扩增技术核酸检测装置。

背景技术：

1、poct指在病人旁边进行的临床检测及床边检测(bedside testing)，通常不一定是临床检验师来进行。是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。

2、现场快速检验由中国医学装备协会poct装备技术专业委员会在多次专家论证基础上统一命名，并将其定义为：在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。

3、poct含义可从两方面进行理解：空间上，在患者身边进行的检验，即“床旁检验”；时间上，可进行“即时检验”。poct的主要标准是不需要固定的检测场所，试剂和仪器都是便携式的，并且可及时操作。poct不需要专门临床检测服务和专门的专业技术人员。

4、一种好的分子poct产品首先得满足能脱离pcr分区实验室使用。这就意味分子poct产品的检测耗材上要能集成核酸提取、核酸扩增的功能。更重要的是，整个实现过程要全密闭，以最大程度地在没有pcr分区实验室的情况下避免pcr产物气溶胶污染。

5、分子诊断技术今日不同以往，着实借力突飞猛进，恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目。rpa(recombinase polymerase amplification)重组酶聚合酶扩增技术，关键技术是3种关键酶或蛋白(重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶，其中重组酶来源于t4噬菌体)，在37℃恒温下进行核酸快速扩增，工作原理要点是：

6、(1)在三磷酸腺苷atp存在条件下，重组酶与引物结合,形成蛋白-核酸聚合体，并搜索配对目标；

7、(2)当引物寻找到配对dna模板，atp水解供应能量，重组酶离开引物，并在dna聚合酶的作用下合成新dna链；

8、(3)同时，单链dna结合蛋白(single stranded dna binding，ssb)同被置换出来的dna单链进行结合，防止dna模板再次形成双链。

9、crispr系统作为新兴的基因编辑和调控工具，具有高度的特异性、灵敏度和灵活性，除在基因编辑和改造方面有重要作用外，在传染病诊断、环境监测、食品安全检测等方面也有着良好的前景。随着crispr/cas系统的深入研究，通过其高特异性识别目标序列和反式切割能力，已经建立了多种简便、灵敏的生物传感平台，解决了传统方法在操作、灵敏度、特异性及检测周期方面存在的不足。

10、crispr/cas系统由于优异的生物传感性能逐渐成为下一代诊断技术的焦点，有望成为开发理想诊断产品的方法，基于crispr/cas系统的特异性结合活性和高效反式切割能力，将其与电化学、荧光传感技术相结合，已经成功实现了各种靶标分子的检测，检测对象也已经从最初的核酸扩展到金属离子、蛋白质、细菌、小分子等，说明了crispr/cas系统在检测领域具有通用性。

11、微流控技术的概念被提出已有30余年，以“微型全分析系统”(μ-tas)和“芯片实验室”(loc)为主要形式。随着微流控技术的日臻成熟，逐步从前期技术攻关进入到产品商业化研发阶段，具有消耗试剂少、检测速度快、易于集成等优势，为其在临床检验领域提供了巨大的发展机遇。

12、微流控技术指的是在微米尺度下对微小量级的流体进行精准操控的一种技术，可以实现多个实验流程在一块芯片上自动完成，具有低消耗、高效率、自动化、集成化、便携化等优势。微流控平台将基于crispr的技术提升到生物分析和临床诊断领域的新水平。

13、微流体系统有几个优点：

14、(1)由于严格的模块分离和密封，交叉污染的风险最小；

15、(2)试剂消耗少，降低了成本；

16、(3)无需任何额外的手动操作即可实现进样和出样；

17、(4)一种通用检测平台，受样品特性(如密度、ph、电导率等)影响较小；

18、(5)通过合理设计微通道可以实现多重检测；

19、(6)在一次芯片测定中，可以依次进行多个级联反应，而不会相互影响。

20、为了解决上述分子poct产品的多功能一体化全密闭的难题，本实用新型设计了一种基于rpa结合crispr/cas 12恒温扩增技术核酸检测装置，该装置集样本采集灭活、核酸免提取、rpa+crispr/cas 12扩增、可视化检测的多功能全密闭的一体机。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供一种基于rpa结合crispr/cas 12恒温扩增技术核酸检测装置，解决了背景技术中所提出的问题。

2、为实现上述目的，本技术提供如下技术方案：一种基于rpa结合crispr/cas 12恒温扩增技术核酸检测装置，包括：样本采集灭活装置、核酸免提取装置、微流控芯片盘操控加样装置、rpa恒温扩增装置、crispr/cas12信号放大装置和可视化层析试纸条检测装置，此外，整个装置使用离心微流控芯片盘进行精细控制和准确操控，保证整个检测过程能够以密闭的自动化和相对独立的方式进行。

3、作为本技术技术方案的一可选方案，所述样本采集灭活装置：进行生物样本的采集和灭活功能，生物样本主要包含口腔拭子和鼻咽拭子。更进一步的，将生物样本放入一种免核酸提取的灭活型样本保存液中进行裂解和灭活，更进一步的，样本保存管内设有2层嵌入式夹板装置，上宽下窄，在一次性采集拭子旋出保存管时，可以起到有效的挤压和刮取采集拭子，保证细胞能有效的转移至样本保存液中裂解和灭活。更进一步的，样本保存液是一种免核酸提取的灭活型保存液，可以通过调节按压进样按钮的档位，使样本保存管底部的针刺穿保存管底部的力度不同，将不同足量的灭活后核酸样本转移至微流控芯片盘操控加样装置。

4、作为本技术技术方案的一可选方案，所述微流控芯片盘操控加样装置：基于微流控芯片盘操控技术，将足量的核酸提取产物注入预先放置的rpa扩增体系的冻干球中；

5、作为本技术技术方案的一可选方案，所述rpa恒温扩增装置：基于微流控芯片盘操控技术进行rpa恒温扩增反应；

6、作为本技术技术方案的一可选方案，所述crispr/cas12扩增装置：基于微流控芯片盘操控技术，将足量的扩增产物注入预先放置的crispr/cas12扩增体系的冻干球中反应；

7、作为本技术技术方案的一可选方案，所述可视化层析试纸条装置：基于微流控芯片盘操控技术，将足量的扩增产物注入可视化层析试纸条的加样孔中进行层析操作和最终的检测结果的呈现。

8、与现有技术相比，本技术的有益效果如下：

9、1.本技术通过得益于rpa恒温扩增技术整个反应非常速度，约25-40min左右就可以得到结果(rpa：25-30分钟，crispr/cas12：5-10分钟)；灵敏度可达10copies/μl；扩增引物长度30-35bp，扩增期间不需要复杂的仪器和设备；本实用新型公开的一种基于rpa结合crispr/cas 12恒温扩增技术核酸检测装置，将样本采集灭活、核酸免提取、离心微流控芯片操控加样、rpa恒温扩增、crispr/cas 12信号放大和可视化层析试纸条检测进行整合的poct装置。为了便于床旁测试应用，在离心微流控芯片盘核酸检测装置中实施了rpa和crispr/cas12a反应，以实现多种病毒的自动化和一体化检测，整个过程在仪器中旋转，加热和光学检测组件的定制紧凑型机器中运行，大大简化了检测结果的使用复杂仪器，不但可以满足快速出具结果的需求，同时可以更好的满足不具备分子检测条件的地区使用。