使用寡核苷酸微阵列进行空间核酸检测的制作方法

本公开文本总体上涉及检测核酸。具体地，本公开文本涉及用于原位确定rna和其他分子的序列(或身份)和位置的方法和组合物。例如，公开了一种用于检测核酸的方法，所述方法包括提供组织样品；提供阵列，其包含附接至所述阵列的表面的多个寡核苷酸探针，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含位置条形码序列、引物结合序列和引发序列；从所述阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针；使所述组织样品与所释放的寡核苷酸探针接触；以及允许所释放的寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中。

背景技术：

1、目前大多数用于分析基因表达模式的技术要么一次仅提供一个或少量基因的空间转录信息，如rna荧光原位杂交(rna fish)，要么以丢失位置信息为代价提供样品中的许多或所有基因的转录信息(如rna测序或基因表达的阵列分析)。

2、空间rna测序(也称为空间转录组学)是最近开发的技术，其用于在空间上解析rna序列数据，从而从单独组织切片中的rna获得局部基因表达数据。用于空间转录组学的方法最初由stahl、lundeberg及同事开发(science 353,第6294期(2016):78-82和美国专利申请号2014/0066318a1)。空间rna测序的其他变体已经描述于美国专利号9371598b2和美国专利申请号2018/0245142a1。此外，现在商业上提供了一种空间rna测序形式(natureprotocols 13,(2018):2501–2534)。在这种方法中，将空间条形码化逆转录寡核苷酸(dt)引物以有序的方式以其5’端附接至显微镜载玻片表面。然后将组织冷冻切片封固在该显微镜载玻片顶部，然后将组织透性化处理以引起rna的释放，使得条形码化引物可以与来自组织的mrna结合。然后条形码化引物用于启动所结合的mrna的逆转录，所得的cdna因而掺入了引物的空间条形码。然后从所得的cdna制备测序文库，并通过dna测序对其进行分析。存在于每个生成的序列中的空间条形码允许将每个单独的mrna转录物的数据映射回其在阵列上的起点，从而映射在组织切片内。该技术和上述专利申请中描述的其他方法的主要缺点是，这些方法不能用于福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)组织，因为这些组织中的rna与组织交联，因此不能通过透性化处理而释放。此外，ffpe组织切片通常已经封固在载玻片上，因此不能作为完整的组织切片封固至阵列载玻片上。

3、一般而言，大多数先前描述的方法具有共同的局限性：它们需要核酸从组织扩散至固体支持物，和/或它们需要在固体支持物上发生显著的生化步骤。这些策略的明显缺点是，核酸通过组织的扩散可能是不均匀的并且难以测量，使得组织的真实含量难以评估。另外，虽然清楚地知道生物化学过程(如引物延伸)可以在固体支持物上发生，但试剂的扩散和混合可能受到限制，从而导致较低的反应效率。此外，固体支持物结合的元件的浓度可能低于最佳值。最后，先前用于空间rna测序的方法通常依赖于单个序列来启动cdna合成，例如，依赖于寡核苷酸-dt引物启动多腺苷酸化rna的cdna合成。然而，这将可以测量的rna限制为仅具有聚a尾的那些，这排除了许多类别的rna和一些信使rna，并且不能仅对目的rna的子集进行特定测量。因此，仍然需要用于在组织切片中的空间信息的背景下分析基因表达信息的更好方法。

4、因此，需要允许确定样品中许多或所有基因的转录信息以及确定这些转录物的位置信息的组合物和方法。

技术实现思路

1、本发明总体上涉及一种用于检测核酸的方法，所述方法包括提供组织样品；提供阵列，其包含附接至所述阵列的表面的多个寡核苷酸探针，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含位置条形码序列、引物结合序列和引发序列；从所述阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针；使所述组织样品与所释放的寡核苷酸探针接触；以及允许所释放的寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中。

技术特征：

1.一种用于检测核酸的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括mrna，并且所述引发序列包括寡核苷酸(dt)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品包含cdna，每个cdna至少包含第一链cdna。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述引发序列与所述第一链cdna中的序列结合。

6.根据权利要求1、4或5所述的方法，其中所述组织样品包含在存在模板转换寡核苷酸的情况下合成的cdna，并且所述引发序列与通过所述模板转换寡核苷酸添加的序列结合。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述第一链cdna包含连接至其3'端的衔接子，并且所述引发序列与所述衔接子结合。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针通过杂交或共价附接至所述阵列表面。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针共享相同的位置条形码，并且由包含与该位置条形码互补的序列的阵列特征结合。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针通过用气态氨切割而从所述阵列表面释放。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针通过光切割而从所述阵列表面释放。

12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针通过限制酶或变性而从所述阵列表面释放。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述寡核苷酸探针从所述阵列表面释放之前或之后，使所述组织样品与所述寡核苷酸探针接触。

14.根据权利要求1和8-13中任一项所述的方法，其中所述组织样品包含指示特定抗体的核酸标签。

15.一种用于检测核酸的方法，所述方法包括：

技术总结
本公开文本总体上涉及检测核酸。具体地，本文公开了用于原位确定RNA和其他分子的序列(或身份)和位置的方法和组合物。本发明总体上涉及一种用于检测核酸的方法，所述方法包括：提供组织样品；提供阵列，其包含附接至所述阵列的表面的多个寡核苷酸探针，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含位置条形码序列、引物结合序列和引发序列；从所述阵列表面释放所述多个寡核苷酸探针；使所述组织样品与所释放的寡核苷酸探针接触；以及允许所释放的寡核苷酸探针扩散至所述组织样品中。

技术研发人员：R·A·艾奇,N·M·桑帕斯,B·J·皮特
受保护的技术使用者：安捷伦科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15