与癌细胞结合并将放射性核素靶向所述细胞的分裂抗体的制作方法

本发明涉及双特异性抗体的新颖形式。在某些实施方案中，本发明进一步涉及具有此新颖形式(其与靶细胞上的抗原结合并且其将放射性核素靶向所述细胞)的抗体，并且涉及其使用方法。

背景技术：

1、在各种临床环境中，通常需要选择性破坏单个细胞或特定细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标是特异性破坏肿瘤细胞，同时保持健康细胞和组织完好无损。

2、在这方面，已经设计了双特异性抗体，其用一个“臂”结合靶细胞上的表面抗原，用第二个“臂”结合诸如药物的效应子部分。已经开发了多种双特异性形式，但开发双特异性抗体的任务绝非易事。

3、在预靶向的放射免疫疗法(prit)中，使用的抗体构建体一方面对肿瘤相关抗原具有亲和力，另一方面对放射性标记的化合物具有亲和力。在第一步中，抗体被施用并定位于肿瘤。随后，施用放射性标记的化合物。由于放射性标记的化合物很小，因此它可以被快速递送至肿瘤，并且未结合的化合物会被快速清除，这减少了肿瘤外的辐射暴露(goldenberg等人theranostics 2012,2(5),523-540)。类似的程序也可用于成像。预靶向可以利用双特异性抗体或使用亲合素-生物素的系统，尽管后者有亲合素/链霉亲合素具有免疫原性的缺点。

4、预靶向的放射免疫疗法或成像的方法通常利用清除剂或阻断剂，其在施用抗体的步骤和施用放射性标记的化合物的步骤之间施用。目的是从血液中清除抗体和/或阻断循环抗体与放射性标记的化合物的结合位点(参见例如karacay等人，bioconj.chem.,13(5),1054-1070(2002))。使用清除剂或阻断剂允许给予足够水平的放射性以进行有效治疗，同时限制不良毒性，但必须谨慎选择时间和剂量，并且清除剂存在引入不良反应诸如免疫反应的风险的可能性。因此，清除阶段的使用是预靶向方法中的复杂方面。

技术实现思路

1、本发明提供了双特异性抗体的新颖形式(其中效应子部分的vh结构域和vl结构域被分成两部分)，及其使用方法。

2、特别地，本发明涉及一组抗体，其包含：

3、i)第一抗体，其包含：

4、a)抗原结合部分，其与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；

5、b)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(vh)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体重链可变结构域(vh)组成；和

6、c)fc结构域，其包含两个亚基，

7、其中(b)的多肽通过其n末端与(a)的抗体结合部分的c末端融合并且通过其c末端与(c)的fc结构域的亚基中的一个的n末端融合；

8、并且其中第一抗体不包含针对效应子部分的抗原结合位点的vl结构域；和

9、ii)第二抗体，其包含：

10、d)抗原结合部分，其与在靶细胞的表面上表达的抗原结合；

11、e)多肽，其包含针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(vl)或由针对效应子部分的抗原结合位点的抗体轻链可变结构域(vl)组成；和

12、f)fc结构域，其包含两个亚基，

13、其中(e)的多肽通过其n末端与(d)的抗原结合部分的c末端融合并且通过其c末端与(f)的fc结构域的亚基中的一个的n末端融合；

14、并且其中第二抗体不包含针对效应子部分的抗原结合位点的vh结构域；

15、其中第一抗体的所述vh结构域和第二抗体的所述vl结构域能够一起形成针对效应子部分的功能抗原结合位点。

16、第一抗体和第二抗体本身都不包含针对效应子部分的功能抗原结合位点。第一抗体仅具有来自针对效应子部分的功能结合位点的vh结构域，而不具有vl结构域。第二抗体只有vl结构域，没有vh结构域。

17、当第一抗体和第二抗体的vh结构域和vl结构域缔合时，形成针对效应子部分的功能抗原结合位点。例如，这可能在第一抗体和第二抗体与同一个体靶细胞或相邻细胞结合时发生。

18、本文所述的第一抗体和第二抗体在本文中可称为“单结构域分裂抗体”、“分裂抗体”、“split”、“半抗体”或“半抗体”。一起形成能够结合效应子部分的抗原结合位点的vh结构域和vl结构域在两种抗体之间分裂，并且不作为相同抗体的一部分存在。

19、分裂结构域形式意味着效应子部分既不能单独与第一抗体结合，也不能单独与第二抗体结合。在血液中，第一抗体和第二抗体之间有很少或没有稳定缔合，因此放射性标记的化合物的结合很少或没有稳定结合。

20、在靶细胞的表面上表达的抗原在本文中可以称为“靶抗原”、“靶细胞抗原”或“ta”。根据本发明，上述第一抗体和第二抗体可具有与不同靶抗原结合或针对相同靶抗原的抗原结合部分。(为避免疑义，在声明抗体结合相同靶抗原的情况下，这意味着它们具有能够与相同靶抗原结合的结合位点，并且包括抗体可能与两个彼此相同的单独的抗原分子结合的可能性)。例如，在一个实施方案中，第一抗体和第二抗体均与cea结合。

21、在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体可以与相同靶抗原的相同表位结合(具有结合位点)。在其他实施方案中，第一抗体和第二抗体可以与相同靶抗原的相同表位结合(具有结合位点)。

22、在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体可以包含靶抗原的相同抗原结合位点。例如，它们可以包含能够与靶抗原结合的抗原结合位点，包括vl和vh序列，其中形成该抗原结合位点的vl和vh序列在第一抗体和第二抗体中是相同的。

23、术语“效应子部分”是指负责对靶细胞产生期望的效果的部分。在一个实施方案中，期望的效果是细胞杀伤。例如，效应子部分可以是用于杀死靶细胞的放射性核素、药物或毒素。在一个实施方案中，效应子部分可以是适用于放射疗法的放射性标记的化合物。在另一个实施方案中，期望的效果是标记并且效应子部分可以是适用于成像的放射性标记的化合物。

24、在一些实施方案中，(a)和(d)的抗原结合部分可以是抗体片段，诸如fv、fab、交叉fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv或scfab)；或单结构域抗体(dab)，诸如vhh；或非抗体结合支架，诸如darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)；亲和；sso7d；单抗体或anticalin。

25、在一些实施方案中，可以优选，(a)的抗原结合部分和(d)的抗原结合部分是fab。在此类实施方案中，(b)的多肽通过其n末端与(a)的fab片段的链中的一条的c末端融合；并且(e)的多肽通过其n末端与(d)的fab片段的链中的一条的c末端融合。同样，在抗原结合部分包含一条以上链的其他实施方案中，多肽可以通过其n末端与链中的一条的c末端融合。

26、fc区的存在在免疫疗法和成像方面具有益处，例如延长蛋白质的循环半衰期和/或导致比使用较小片段观察到的更高的肿瘤摄取。本文所述的“分裂结构域”形式在这种情况下可能特别有利，因为它减轻了与效应子部分/放射性标记的化合物缔合的更大可能性，否则这种可能性会由于循环抗体的长期存在而发生。在一些实施方案中，修饰fc结构域以降低或消除fc效应子功能。

27、本文描述的形式避免了效应子部分的vl和vh的显著脱靶关联。此外，根据本发明的抗体可以具有在降低抗药物抗体反应和/或稳定性方面的优势。

28、在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含如本文所述的一组抗体。在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含两种单独的药物组合物，每种药物组合物包含一种本文所述的抗体(即分别为第一抗体和第二抗体)。

29、在进一步方面，本发明涉及编码本文所述的任何抗体或抗体组的多核苷酸或多核苷酸组。另一方面，本发明涉及包含所述多核苷酸或多核苷酸的载体或载体组，任选地涉及表达载体或一组表达载体。在进一步的目的中，本发明涉及包含本发明的载体或载体组的原核或真核宿主细胞或宿主细胞组。此外，提供了产生抗体的方法，该方法包含培养宿主细胞以产生抗体。

30、在一些实施方案中，其中效应子分子是放射性标记的化合物，如本文所述的抗体可用于预靶向的放射免疫疗法(prit)的方法或预靶向的放射成像的方法。

31、在一个方面，本发明提供了预靶向的放射免疫疗法的方法，其包含：

32、i)向受试者施用如上所述的第一抗体和第二抗体；和

33、ii)随后向所述受试者施用放射性标记的化合物。

34、在另一个方面，本发明提供了用于治疗方法的上述第一抗体和第二抗体，该治疗方法包含将第一抗体和第二抗体施用于受试者，并且随后将放射性标记的化合物施用于所述受试者。在另一个方面，本发明提供了用于治疗方法的上述第一抗体，该治疗方法包含将第一抗体和第二抗体施用于受试者，并随后将放射性标记的化合物施用于所述受试者。在另一个方面，本发明提供了用于治疗方法的上述第二抗体，该治疗方法包含将第一抗体和第二抗体施用于受试者，并随后将放射性标记的化合物施用于所述受试者。

35、在另一方面，本发明提供了放射成像的方法，其包含：

36、i)向受试者施用本文所述的第一抗体和第二抗体，其中抗体与靶抗原结合并定位于表达靶抗原的细胞的表面；

37、ii)随后施用放射性标记的化合物；并且任选地

38、iii)对放射性核素定位的组织或器官进行成像。

39、在另一个方面，本发明提供了在人体或动物体上进行的诊断方法中使用的如本文所述的第一抗体和第二抗体，其中该方法包含

40、i)向受试者施用本文所述的第一抗体和第二抗体，其中抗体与靶抗原结合并且定位于表达靶抗原的细胞的表面；

41、ii)随后施用放射性标记的化合物；并且任选地

42、iii)对放射性核素定位的组织或器官进行成像。

43、成像步骤之后可以是形成诊断的步骤和任选地将该诊断传递给受试者的步骤。在一些实施方案中，该方法可以进一步包含确定合适的治疗和任选地将该治疗施用于受试者。

44、在上述方法/用途中的每一个中，第一抗体和第二抗体与相同或相邻靶细胞的结合导致了放射性标记的化合物的抗原结合位点的vh结构域和vl结构域的缔合和放射性标记的化合物的功能抗原结合位点的形成。因此，在施用放射性标记的化合物后，放射性标记的化合物与由vh和vl缔合形成的功能抗原结合位点结合。

45、在本文所述的任何方法和用途中，第一抗体和第二抗体可以同时或以任一顺序依次施用。

46、在本领域中，prit或放射成像的方法经常涉及清除步骤。清除步骤包含在施用抗体和施用放射性标记的化合物之间施用药剂，其中该药剂增加了将抗体从血液中去除的速率和/或阻断放射性标记的化合物与抗体的结合。

47、在本文所述的方法和用途的实施方案中，该方法不包含清除步骤。即，它不包含在施用第一抗体和第二抗体和施用放射性标记的化合物之间施用清除剂或阻断剂的步骤(即，在施用抗体之后但在施用放射性标记的化合物之前)。在另一个实施方案中，在施用第一抗体和第二抗体与施用放射性标记的化合物之间不施用药剂，除了任选地放射增敏剂、免疫治疗剂和/或化学治疗剂。在另一个实施方案中，在施用第一抗体和第二抗体与施用放射性标记的化合物之间不施用药剂。

48、在一些实施方案中，本文所述的抗体可以作为联合疗法的一部分施用。例如，它们可以与一种或多种放射增敏剂、免疫治疗剂和/或化学治疗剂组合施用：放射增敏剂、免疫治疗剂或化学治疗剂和抗体可以同时或以任一顺序依次施用。

49、如本文进一步讨论的，本文所述的放射成像和放射免疫疗法的方法可以任选地组合。

50、在进一步方面，本发明提供了试剂盒，其包含：

51、i)如本文所述的第一抗体和第二抗体；

52、ii)放射性标记的化合物，其与由第一抗体和第二抗体缔合形成的抗原结合位点结合。

53、任选地，该试剂盒可以不包括(即，不包含)如本文所述的清除剂或阻断剂。

54、任选地，该试剂盒可以进一步包含放射增敏剂、免疫治疗剂或化学治疗剂。

55、在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体可以存在于相同的药物组合物中。在其他实施方案中，第一抗体和第二抗体可以存在于单独的药物组合物中。在一些实施方案中，放射性标记的化合物存在于与抗体分开的药物组合物中。

56、在其他实施方案中，如本文所述的抗体可用于选择性杀死靶细胞的方法，例如，用于癌症治疗。