用于基于CRISPR的转录抑制的融合蛋白的制作方法

本发明涉及基于crispr的转录抑制的领域。

背景技术：

1、生物技术界现在十分熟悉crispr-cas9系统，该系统允许基因的特定靶向和编辑。这个系统最初是在古细菌和细菌中发现的，但最有希望的是用于人类。

2、基本的crispr/cas9系统包含cas9蛋白和向导rna(“grna”)。基于间隔区序列和靶位点序列之间的互补性，grna中的间隔区序列(也称为靶向序列)将cas9蛋白导向基因组靶位点。cas9蛋白被带到靶位点后，它可以切割靶dna并导致dna编辑。或者，失活的cas9(“dcas9”)可用于序列特异性靶向并带来具有不同功能的其它效应子。

3、因为crispr/cas9系统在定位和编辑靶位点方面是有效的，所以研究人员已经探索了在该系统上搭载的方法，以便引入除了那些可能由天然存在的cas9蛋白的活性位点引起的功能之外的功能。此外，研究人员已经开始探索使用其它依赖grna特异性的cas蛋白，以便将这些蛋白带到靶位点。

4、虽然研究人员最初在低等生物中发现了crispr-cas9系统，但该系统已成功用于哺乳动物细胞中的基因编辑应用，m.jinek,et al.,“a programmabledual-rna-guideddna endonuclease in adaptive bacterial immunity,”science.337:p.816-821(2012)。此外，研究人员已经能够通过将点突变引入催化残基(在常用的酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)cas9蛋白的情况下为d10a和h840a)来消除cas蛋白的核酸酶活性，从而产生失活的cas9，当由序列特异性向导rna指导时，该cas9保持结合靶dna的能力。当dcas9融合至转录调节因子并被引导至基因启动子区时，它诱导rna指导的转录调节。基于crispr的转录调控技术包括用于转录抑制的crispr干扰(crispri)和用于转录上调的crispr激活(crispra)(qi,l.s.,et al.,“repurposing crispr as an rna-guidedplatform for sequence-specific control of gene expression,”cell,152(5):p.1173-83(2013)；a.w.cheng,et al.,“multiplexed activation of endogenous genesby crispr-on,an rna-guided transcriptional activator system,”cell res.,23(10):p.1163-71(2013))。

5、一种已知的基于crispr的转录抑制方法利用来自锌指蛋白10(kox1)的krüppel相关盒(krab)结构域作为转录抑制物，l.a.gilbert,et al.,“crispr-mediated modularrna-guided regulation of transcription in eukaryotes,”cell,154(2):p.442-51(2013)；l.a.gilbert et al.,“genome-scale crispr-mediated control of generepression and activation,”cell,159:p.647–661(2014)。然而，这种方法有其局限性。研究人员已经表明，它不能在所有应用中提供足够的抑制，并且使用它会导致对靶基因的不太强的抑制，l.stojic et al.,“specificity of rnai,lna and crispri as loss-of-function methods in transcriptional analysis,”nucleic acids research,46(12):p.5950–5966(2018)；yeo,et al.,“an enhanced crispr repressor for targetedmammalian gene regulation,”nat.methods,15(8):p.611-616(2018)。鉴于在crispr-krab融合蛋白(最常用于转录抑制的融合蛋白)表现方面的报道的可变性，需要额外的基于crispr的转录抑制方法。

技术实现思路

1、本发明提供了新型的融合蛋白，编码这些蛋白的核酸序列，以及通过使用这些蛋白和/或核酸进行基因抑制的方法。通过使用本发明的各种实施方案，人们可以高效和有效地调节基因表达。

2、根据第一实施方案，本发明提供了包含cas蛋白以及sall1抑制结构域和suds3抑制结构域中的一者或两者的cas融合蛋白。在一些实施方案中，cas蛋白是失活的，这也可以被称为死的或减毒的。

3、根据第二实施方案，本发明提供了编码本发明的cas融合蛋白的核酸。

4、根据第三实施方案，本发明提供了rna抑制结构域复合物。rna抑制结构域复合物包含：(a)grna分子，其中grna分子包含30至180个核苷酸；(b)配体结合部分，其中配体结合部分或者(i)直接与grna分子结合，或者(ii)通过配体结合部分接头与grna分子结合；(c)配体，其中配体能够与配体结合部分可逆地结合；和(d)融合蛋白，其中融合蛋白包含sall1抑制结构域和suds3抑制结构域，并且其中融合蛋白或者(i)直接与配体结合，或者(ii)通过接头与配体结合。

5、根据第四实施方案，本发明提供了调节靶核酸表达的方法，包括将本发明的cas融合蛋白或rna抑制结构域复合物或本发明的核酸引入细胞(例如真核细胞)或生物体(例如哺乳动物，诸如人)。在一些实施方案中，引入是体内、体外或离体的。

6、根据第五实施方案，本发明提供了包含本发明的cas融合蛋白或编码本发明的cas融合蛋白的核酸的试剂盒，并且在一些实施方案中，还可以包含grna或编码grna的核酸。

7、根据第六实施方案，本发明提供了试剂盒，其包含rna-抑制结构域复合物或编码两个分子(本发明的rna配体结合结构域和配体抑制物)的核酸。

8、根据第七实施方案，本发明提供了蛋白质，其包含与seq id no:10具有至少80％相似性的序列，或基本由与seq id no:10具有至少80％相似性的序列组成，或由与seq idno:10具有至少80％相似性的序列组成。

技术特征：

1.cas融合蛋白，其包含cas蛋白以及sall1抑制结构域和suds3抑制结构域中的一者或两者。

2.根据权利要求1所述的cas融合蛋白，其中所述cas融合蛋白包含sall1抑制结构域。

3.根据权利要求1所述的cas融合蛋白，其中所述cas融合蛋白包含suds3抑制结构域。

4.根据权利要求1所述的cas融合蛋白，其中所述cas融合蛋白包含sall1抑制结构域和suds3抑制结构域。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的cas融合蛋白，其还包含额外的抑制结构域，其中所述额外的抑制结构域是不同于sall1抑制结构域或suds3抑制结构域的抑制结构域。

6.根据权利要求5所述的cas融合蛋白，其中所述额外的抑制结构域是nipp1抑制结构域。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是无催化活性的。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是切口酶。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白为活性或失活形式的cas9。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是v型cas蛋白。

11.根据权利要求10所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白选自由cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12h、cas12i和cas12j组成的组。

12.根据权利要求11所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是cas12a。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的cas融合蛋白，其中所述cas融合蛋白还包含cas接头。

14.根据权利要求13所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头是包含与seq id no:7具有至少80％相似性的序列的氨基酸序列。

15.根据权利要求14所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头包含seq id no:7。

16.根据权利要求15所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头是seq id no:7。

17.根据权利要求13所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白具有n末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白包含suds3抑制结构域，并且所述cas接头与所述cas融合蛋白的suds3抑制结构域和n末端氨基酸结合。

18.根据权利要求13所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白具有n末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白包含sall1抑制结构域，并且所述cas接头与所述cas融合蛋白的sall1抑制结构域和n末端氨基酸结合。

19.根据权利要求13所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白具有c末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白包含suds3抑制结构域，并且所述cas接头与所述cas融合蛋白的suds3抑制结构域和c末端氨基酸结合。

20.根据权利要求13所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白具有c末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白包含sall1抑制结构域，并且所述cas接头与所述cas融合蛋白的sall1抑制结构域和c末端氨基酸结合。

21.根据权利要求2或权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述sall1抑制结构域包含与seq id no:1具有至少80％相似性的序列。

22.根据权利要求2或权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述sall1抑制结构域包含seq id no:1。

23.根据权利要求3或权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述suds3抑制结构域包含与seq id no:2具有至少80％相似性的序列。

24.根据权利要求3或权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述suds3抑制结构域包含seq id no:2。

25.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述sall1抑制结构域包含与seq id no:1具有至少80％相似性的序列，并且所述suds3抑制结构域包含与seq id no:2具有至少80％相似性的序列。

26.根据权利要求25所述的cas融合蛋白，其中所述sall1抑制结构域包含seq id no:1，并且所述suds3抑制结构域包含seq id no:2。

27.根据权利要求25所述的cas融合蛋白，其中所述sall1抑制结构域是seq id no:1，并且所述suds3抑制结构域是seq id no:2。

28.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是dcas9蛋白，其中所述dcas9蛋白具有c末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白还包含cas接头和抑制接头，其中所述cas接头与dcas9蛋白的c末端氨基酸和sall1抑制结构域的n末端氨基酸共价结合，并且其中所述抑制接头与sall1抑制结构域的c末端氨基酸和suds3抑制结构域的n末端氨基酸结合。

29.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是dcas9蛋白，其中所述dcas9蛋白具有c末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白还包含cas接头和抑制接头，其中所述cas接头与所述dcas9蛋白的c末端氨基酸和suds3抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与所述suds3抑制结构域和sall1抑制结构域结合。

30.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是dcas9蛋白，其中所述dcas9蛋白具有n末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白还包含cas接头和抑制接头，其中所述cas接头与dcas9蛋白的n末端氨基酸和sall1抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与sall1抑制结构域和suds3抑制结构域结合。

31.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是dcas9蛋白，其中所述dcas9蛋白具有n末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白还包含cas接头和抑制接头，其中所述cas接头与所述dcas9蛋白的n末端氨基酸和suds3抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与所述suds3抑制结构域和sall1抑制结构域结合。

32.根据权利要求28至31中任一项所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头和所述抑制接头各自包含长度为3至90个氨基酸的氨基酸序列。

33.根据权利要求32所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头和所述抑制接头各自包含seq id no:7。

34.根据权利要求33所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头和所述抑制接头各自是seqid no:7。

35.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是cas12a蛋白，其中所述cas12a蛋白具有c末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白还包含cas接头和抑制接头，其中所述cas接头与所述cas12a蛋白的c末端氨基酸和sall1抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与sall1抑制结构域和suds3抑制结构域结合。

36.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是cas12a蛋白，其中所述cas12a蛋白具有c末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白还包含cas接头和抑制接头，其中所述cas接头与所述cas12a蛋白的c末端氨基酸和suds3抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与suds3抑制结构域和sall1抑制结构域结合。

37.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是cas12a蛋白，其中所述cas12a蛋白具有n末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白还包含cas接头和抑制接头，其中所述cas接头与cas12a蛋白的n末端氨基酸和sall1抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与sall1抑制物和suds3抑制结构域结合。

38.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas蛋白是cas12a蛋白，其中所述cas12a蛋白具有n末端氨基酸，并且所述cas融合蛋白还包含cas接头和抑制接头，其中所述cas接头与所述cas12a蛋白的n末端氨基酸和suds3抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与suds3抑制结构域和sall1抑制结构域结合。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头和所述抑制接头各自包含seq id no:7。

40.根据权利要求39所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头和所述抑制接头各自是seqid no:7。

41.根据权利要求40所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头和所述抑制接头各自包含seq id no:7。

42.根据权利要求41所述的cas融合蛋白，其中所述cas接头和所述抑制接头各自是seqid no:7。

43.根据权利要求4所述的cas融合蛋白，其中所述cas融合蛋白包含与seq id no:10具有至少80％相似性的序列。

44.根据权利要求43所述的cas融合蛋白，其中所述cas融合蛋白包含seq id no:10的序列。

45.核酸，其编码权利要求1至44中任一项所述的cas融合蛋白。

46.根据权利要求45所述的核酸，其中所述核酸存在于载体中。

47.根据权利要求46所述的核酸，其中所述载体是质粒或病毒载体。

48.根据权利要求47所述的核酸，其中所述核酸存在于病毒载体，所述病毒载体选自由慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、冠状病毒和仙台病毒组成的组中。

49.调节真核细胞中靶核酸表达的方法，其包括向细胞提供grna和权利要求1至44中任一项所述的cas融合蛋白。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述grna是在细胞外合成的，并且其中通过向细胞引入编码cas融合蛋白的mrna来向细胞提供cas融合蛋白。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。

54.根据权利要求49所述的方法，其中所述提供包括从载体获得grna和cas融合蛋白，其中所述载体编码grna和cas融合蛋白。

55.根据权利要求49所述的方法，其还包括在细胞外合成grna和在细胞外合成cas融合。

56.调节真核细胞中靶核酸表达的方法，所述方法包括向细胞提供权利要求1至44中任一项所述的cas融合蛋白和rna-抑制结构域复合物，其中rna-抑制结构域复合物包含：

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述真核细胞是人类细胞。

58.试剂盒，其包含权利要求1至44中所述的cas融合蛋白和rna抑制结构域复合物，其中所述rna抑制结构域复合物包含：

59.rna抑制结构域复合物，其中所述rna抑制结构域复合物包含：

60.根据权利要求59所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna分子包含crrna序列。

61.根据权利要求60所述的rna抑制结构域复合物，其中所述crrna序列包含靶向序列，其中所述靶向序列的长度为12至30个核苷酸。

62.根据权利要求60所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna分子还包含tracrrna序列。

63.根据权利要求59所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna分子包含tracrrna序列。

64.根据权利要求59所述的rna抑制结构域复合物，其包含所述配体接头，其中所述配体接头是氨基酸序列。

65.根据权利要求59至64中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna为sgrna分子，且所述sgrna分子具有3’末端，且所述配体结合部分在所述3’末端与所述grna分子连接。

66.根据权利要求59至64中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna分子为sgrna分子，且所述sgrna分子具有5’末端，且所述配体结合部分在所述5’末端与所述grna分子连接。

67.根据权利要求59至64中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna分子为sgrna分子，且所述sgrna分子形成至少一个茎环结构，且所述配体结合部分在所述至少一个茎环结构中的其中一个与所述grna分子连接。

68.根据权利要求67所述的rna抑制结构域复合物，其中所述茎环结构中的至少一个茎环结构的长度为4至40个核苷酸。

69.根据权利要求59至64中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna是sgrna分子，且所述sgrna分子包含至少一个2’修饰的核苷酸。

70.根据权利要求59至64中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna分子是sgrna分子，且所述sgrna分子包含至少一个硫代磷酸酯连接键。

71.根据权利要求59至64中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna分子是sgrna，且所述sgrna包含tracrrna序列和crrna序列。

72.根据权利要求59至64中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna分子包含第一rna分子和第二rna分子，其中所述第一rna分子包含tracrrna序列，所述第二rna分子包含crrna序列，所述tracrrna序列包含反重复区，且所述crrna序列包含cas结合区，其中所述反重复区和所述cas结合区在至少18个核苷酸的跨度上至少80％互补。

73.根据权利要求72所述的rna抑制结构域复合物，其中所述第一rna分子和所述第二rna分子各自具有3’末端，且所述配体结合部分与所述第一rna分子的3’末端或所述第二rna分子的3’末端连接。

74.根据权利要求72所述的rna抑制结构域复合物，其中所述第一rna分子和所述第二rna分子各自具有5’末端，且所述配体结合部分与所述第一rna分子的5’末端或所述第二rna分子的5’末端连接。

75.根据权利要求72所述的rna抑制结构域复合物，其中所述第一rna分子和所述第二rna分子中的任一者或两者包含至少一个2’修饰的核苷酸。

76.根据权利要求72所述的rna抑制结构域复合物，其中所述第一rna分子和所述第二rna分子中的任一者或两者包含至少一个硫代磷酸酯连接键。

77.根据权利要求59所述的rna抑制结构域复合物，其还包含cas蛋白。

78.根据权利要求77所述的rna抑制结构域复合物，其中所述cas蛋白是ii型cas蛋白。

79.根据权利要求78所述的rna抑制结构域复合物，其中所述cas蛋白是失活的。

80.根据权利要求78所述的rna抑制结构域复合物，其中所述cas蛋白是dcas9。

81.根据权利要求77所述的rna抑制结构域，其中所述cas蛋白是v型cas蛋白。

82.根据权利要求81所述的rna抑制结构域复合物，其中所述cas蛋白是失活的。

83.根据权利要求82所述的rna抑制结构域复合物，其中所述cas蛋白是dcas12a。

84.根据权利要求59所述的rna抑制结构域复合物，其中所述配体选自由以下项组成的组：ms2、ku、pp7、sfmu、sm7、tat、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、csy4、qbeta、com、pumilio、lambda n22和pdgfβ链。

85.根据权利要求84所述的rna抑制结构域复合物，其中所述配体是ms2。

86.根据权利要求59所述的rna抑制结构域复合物，其中所述融合蛋白包含与seq idno:10具有至少80％相似性的序列。

87.根据权利要求86所述的rna抑制结构域复合物，其中所述cas融合蛋白包含seq idno:10的序列。

88.用于转录抑制的方法，其包括将权利要求59至87中任一项所述的rna抑制结构域复合物暴露于双链dna中。

89.根据权利要求88所述的方法，其中所述方法在体外进行。

90.根据权利要求88所述的方法，其中所述方法在体内进行。

91.根据权利要求88所述的方法，其中所述方法离体进行。

92.试剂盒，其包含权利要求59至87中任一项所述的rna抑制结构域复合物。

93.治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1至44中任一项所述的cas融合蛋白。

94.根据权利要求93所述的方法，其还包括施用grna。

95.根据权利要求94所述的方法，其还包括施用编码所述grna的mrna。

96.治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求59至76中任一项所述的抑制结构域复合物。

97.根据权利要求96所述的方法，其还包括施用cas蛋白。

98.根据权利要求97所述的方法，其还包括施用编码cas蛋白的mrna。

99.根据权利要求59至63中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna具有：

100.根据权利要求59至63中任一项所述的rna抑制结构域复合物，其中所述grna具有：

101.调节细胞中靶核酸表达的方法，其包括向细胞提供sgrna和权利要求1所述的cas融合蛋白。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述sgrna经化学修饰。

103.根据权利要求101或权利要求102所述的方法，其中所述sgrna具有长度为12至30个核苷酸的间隔区。

104.调节细胞中靶核酸表达的方法，其包括向细胞提供crrna分子、tracrrna分子和权利要求1所述的cas融合蛋白。

105.根据权利要求104所述的方法，其中所述crrna分子和所述tracrrna分子中的一者或两者经化学修饰。

106.根据权利要求104或权利要求105所述的方法，其中所述crrna分子具有长度为12至30个核苷酸的间隔区。

技术总结
本公开提供了用于调节核酸表达的组合物以及使用这些组合物的方法。所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白含有SALLI和SUDS3中的一者或两者的抑制结构域。在一些实施方案中，组合物是可与gRNA或其它RNA组合使用的Cas融合蛋白。额外或可选地，组合物是RNA抑制结构域复合物。

技术研发人员：C·米尔斯,J·席尔,Z·斯特雷佐斯卡
受保护的技术使用者：达尔马科恩有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16