针对CD47的单域抗体及其用途的制作方法

本发明涉及针对作为免疫检查点蛋白(immune checkpoint protein)的cd47的单域抗体(singledomain antibody)及其用途。

背景技术：

1、近来，随着利用人体免疫系统新开发的免疫抗癌疗法的治疗效果得到证明，现有的利用化学治疗剂以及靶向治疗剂的抗癌治疗方法正逐渐转变为利用免疫治疗剂的免疫抗癌疗法。

2、基本上，癌症患者的免疫细胞对癌症抗原产生耐性(tolerance)，虽然可以识别癌细胞，但功能被抑制，因此无法有效清除癌细胞。免疫治疗的核心是唤醒陷入耐性的免疫细胞并诱导为激活的免疫细胞来破坏癌细胞。这样的免疫治疗中有γ干扰素(ifn-γ)、白细胞介素2(il-2)等细胞因子治疗剂、利用树突状细胞的癌症疫苗、利用t细胞的细胞治疗剂、阻断免疫检查点蛋白的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ici)等，这些治疗剂通常称为免疫抗癌剂(immuno-oncology therapy)。其中，国际性的制药公司竞相开发的免疫抗癌剂为免疫检查点抑制剂。

3、免疫检查点蛋白为细胞膜蛋白，抑制免疫细胞的分化、增殖、活性。具体地，该蛋白大体上在激活的t细胞中表达，减少t细胞的增殖、细胞因子分泌、细胞毒性，具有抑制t细胞的过度活性的功能，因此也称为共抑制(co-inhibitory)分子。代表性地，t细胞中表达作为共抑制受体的ctla-4和pd-1，通过与它们各自的配体b7.1/2及pd-l1的结合来调节t细胞的活性。另一方面，pd-l1在癌细胞中表达，灭活癌症特异性的t细胞并诱导细胞凋亡，从而起到从t细胞的免疫攻击中保护癌细胞的分子屏障(molecular shield)作用，因此也成为癌症的免疫回避机制。并且，据报告，癌细胞中以异位性(ectopic)表达pd-l1的癌症患者的预后比不是如此的癌症患者的预后更糟。

4、免疫检查点抑制剂为通过抑制这样的与t细胞抑制相关的免疫检查点蛋白的活性以激活t细胞来攻击癌细胞的药剂，代表性地使用识别ctla-4、pd-1、pd-l1的抗体。作为ctla-4抑制剂的易普利姆玛(ipilimumab(yervoy))在免疫检查点抑制剂中首次作为对转移黑色素瘤的二次治疗剂于2011年获得美国食品药品监督管理局(fda)的批准。此后，2014年，作为pd-1阻断剂的纳武单抗(nivolumab(opdivo))和派姆单抗(pembrolizumab(keytruda))对于转移黑色素瘤分别获得美国食品药品监督管理局的批准。此后，作为对于pd-l1的免疫检查点抑制剂的阿替利珠单抗(atezolizumab(tecentriq))对于膀胱癌(2016年)、阿维单抗(avelumab(bavencio))对作为皮肤癌之一的转移默克尔细胞癌的治疗、度伐利尤单抗(durvalumab(imfinzi))对于膀胱癌于2017年获得美国食品药品监督管理局的批准。2018年，作为pd-1抑制剂的西米普利单抗(cemiplimab(libtayo))对于皮肤扁平上皮癌获得美国食品药品监督管理局的批准。现在，随着这些药剂治疗适应症的逐渐扩大，在越来越多的癌症治疗中获得美国食品药品监督管理局的批准。2019年，现有的6种pd-1/pd-l1抑制剂对于共18中癌症获得美国食品药品监督管理局的批准。此外，b7-h4、icos、hvem、pdl-2、pvrig等免疫调节蛋白作为新的目标进入临床前试验。大部分这样的治疗剂以t细胞上表达的目标为靶向。

5、为了克服这样的以t细胞为中心的偏向性的目标发掘倾向，近来正在开发以在巨噬细胞、树突状细胞等骨髓(myeloid)系列的细胞中表达的免疫检查点蛋白为靶向的抑制剂。其中，csf1r、cd47、tlr7等一跃成为重要的目标。

6、1980年首次在人卵巢癌中鉴定为肿瘤抗原的cd47(分化簇47(cluster ofdifferentiation 47))在包括非霍奇金淋巴瘤(nhl)、多发性骨髓瘤(mm)、急性淋巴细胞白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病、膀胱癌及固体癌在内的大多数人肿瘤细胞中表达。

7、cd47在细胞表面表达，通过与sirpα(sirpa)、血小板反应蛋白-1(tsp1)及整联蛋白相互作用来与细胞的凋亡、增殖及免疫反应相关。尤其是在肿瘤细胞中表达的cd47通过与在巨噬细胞(macrophage)表面表达的sirpα相互作用来释放“不要吞噬我”的信号，从而不仅回避巨噬细胞的吞噬作用(phagocytosis)，还在肿瘤环境内增殖血管并抑制效应t细胞t细胞(effector t-cell)的作用来促进肿瘤细胞的增殖及生长。

8、作为国际制药公司的吉利德科学公司的莫洛利单抗(magrolimab)为以cd47为靶向的抗体治疗剂，已在进行临床试验，最近多国国际性的制药公司正在开发基于cd47抗体治疗剂的双抗体。

9、于是，本发明人开发以免疫检查点蛋白为靶向的免疫检查点抑制剂，从而提出本技术。

10、现有技术文献

11、专利文献

12、美国公开专利第2020-0181259号

13、国际公开专利第2011-143624号

14、非专利文献

15、pol specenier(2016):ipilimumab in melanoma,expert review ofanticancer therapy.

16、db johnson,c peng et al.nivolumab in melanoma:latest evidence andclinical potential.ther adv med oncol 2015,vol.7(2)97-106

17、liu j,wang l,zhao f,tseng s,narayanan c,shura l,et al.(2015)pre-clinical development of a humanized anti-cd47 antibody with anti-cancertherapeutic potential.plos one 10(9):e0137345.

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的目的在于，提供针对作为免疫检查点蛋白的cd47的单域抗体及其用途。

3、技术方案

4、为了实现本发明的目的，本发明提供一种包含与cd47特异性结合的单域抗体(sdab)的抗体或其抗原结合片段。

5、上述sdab包含：由序列3及序列6中的任一种表示的氨基酸序列形成的cdr1；由序列4及序列7中的任一种表示的氨基酸序列形成的cdr2；以及由序列5及序列8中的任一种表示的氨基酸序列形成的cdr3。

6、在本发明的一实施方式中，上述sdab可以包含：(1)由序列3表示的氨基酸序列形成的cdr1；由序列4表示的氨基酸序列形成的cdr2；以及由序列5表示的氨基酸序列形成的cdr3，或者(2)由序列6表示的氨基酸序列形成的cdr1；由序列7表示的氨基酸序列形成的cdr2；以及由序列8表示的氨基酸序列形成的cdr3。

7、并且，上述sdab可以包含下述vhh结构域：由序列11及序列15中的任一种表示的氨基酸序列形成的fr1；由序列12及序列16中的任一种表示的氨基酸序列形成的fr2；由序列13及序列17中的任一种表示的氨基酸序列形成的fr3；以及由序列14及序列18中的任一种表示的氨基酸序列形成的fr4。更具体地，上述vhh结构域可以包含：(1)由序列11表示的氨基酸序列形成的fr1；由序列12表示的氨基酸序列形成的fr2；由序列13表示的氨基酸序列形成的fr3；以及由序列14表示的氨基酸序列形成的fr4；或者(2)由序列15表示的氨基酸序列形成的fr1；由序列16表示的氨基酸序列形成的fr2；由序列17表示的氨基酸序列形成的fr3；以及由序列18表示的氨基酸序列形成的fr4。在一部分实例中，可以包含序列1及序列2中的任一种表示的氨基酸序列。

8、在本发明的一实施方式中，上述sdab可以包含至少一个氨基酸取代，上述至少一个氨基酸取代可以为保守性取代，可以为氨基酸被非遗传编码氨基酸或合成氨基酸取代。

9、在本发明的一实施方式中，上述sdab可以为单体性或多聚体性。在多聚体性的情况下，上述sdab之间可以通过肽接头融合。

10、在本发明的一实施方式中，提供上述sdab融合在fc片段上的仅重链抗体(hcab)。在一部分实例中，上述hcab可以由序列9、序列10及序列19中的任一种表示的氨基酸序列形成。

11、在本发明的一实施方式中，上述hcab可以为单体性或多聚体性。

12、在本发明的一实施方式中，sdab可以通过肽接头与上述fc片段融合，上述fc片段可以为人igg1、igg2、igg3或igg4。

13、在本发明的一实施方式中，上述hcab可以包含至少一个氨基酸取代，上述至少一个氨基酸取代可以为保守性取代，可以为氨基酸被非遗传编码氨基酸或合成氨基酸取代。

14、在本发明的一实施方式中，提供一种抗体，包含：(a)包含上述sdab的第一抗原结合部位；以及(b)与第二表位特异性结合的第二抗原结合部位。

15、在本发明的一实施方式中，上述抗体可以为双特异性或多特异性。

16、在本发明的一实施方式中，上述第二抗原结合部位可以通过肽接头与第一抗原结合部位相互融合，上述第二抗原结合部位可以为全长抗体、fab、fab'、(fab')2、fv、单链fv(scfv)、scfv-scfv、微抗体、双特异抗体或第二sdab。

17、在本发明的一实施方式中，可以与免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性药物、化疗药物、诊断剂、抗病毒剂、抗微生物剂或药物偶联。于是，本发明提供与免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性药物、化疗药物、诊断剂、抗病毒剂、抗微生物剂或药物偶联的包含上述抗体或其抗原结合片段的抗体偶联物。

18、并且，本发明提供编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

19、并且，本发明提供包含上述核酸分子的表达载体。

20、并且，本发明提供由上述表达载体转化的宿主细胞。

21、并且，本发明提供生产抗体或其抗原结合片段的方法，包括：

22、步骤(a)，在允许抗体表达的条件下培养上述宿主细胞；以及

23、步骤(b)，回收表达的抗体或其抗原结合片段。

24、并且，本发明提供：包含上述抗体或其抗原结合片段或上述抗体偶联物作为有效成分的用于预防或治疗癌症的药物组合物；包括以药物有效量向个体给药上述抗体或其抗原结合片段或上述抗体偶联物的步骤的预防或治疗癌症的方法；以及上述抗体或其抗原结合片段或者上述抗体偶联物在癌症的预防或治疗中的用途。

25、在本发明的一实施方式中，上述癌症可以选自由黑色素瘤、肺癌、肝癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、大肠癌、头颈部癌、膀胱癌、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、转移癌、前列腺癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、孤立性骨髓瘤及再生障碍性贫血组成的组中。

26、在本发明的一实施方式中，上述药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。

27、同时，本发明提供在试样中检测cd47或确定cd47的量的方法，包括：

28、步骤(i)，使试样与上述抗体或其抗原结合片段接触；以及

29、步骤(ii)，检测上述抗体或其抗原结合片段与cd47之间复合物的形成或确定复合物的量。

30、发明的效果

31、在本发明中，制备与作为免疫检查点蛋白的cd47特异性结合的单域抗体并确认其对免疫抗原的亲和度及抗肿瘤效果，可以在免疫抗癌疗法中将上述单域抗体有效用作免疫检查点抑制剂。