病原目标的环介导等温扩增(LAMP)分析的制作方法

背景技术：

1、聚合酶链式反应(pcr)是一种分子生物学技术，其允许核苷酸扩增以用于各种分析目的。定量pcr(qpcr)是pcr的一种改进，其允许监测靶标核苷酸的扩增。诊断qpcr已应用于检测指示感染性疾病、癌症和遗传异常的核苷酸。逆转录pcr(rt-pcr)是qpcr的一种改进，其允许检测目标rna核苷酸。由于这种能力，rt-pcr非常适合检测病毒病原体。然而，rt-pcr使用的大型设备在某些即时医疗(point of care)环境中可能无法使用。此外，rt-pcr使用经过培训的人员、大量的样品制备以及执行和获得结果的时间。

2、相比之下，环介导等温扩增(lamp)是一种更简单的目标核苷酸诊断鉴定方法。具体地，lamp是用于倍增具体核苷酸序列的单操作核酸扩增方法。除了使用等温加热过程之外，lamp还可使用简单的视觉输出测试指示(如颜色变化)而非pcr使用的更复杂的荧光指示。逆转录lamp(rt-lamp)可以像rt-pcr一样使用以从rna中鉴定目标核苷酸，并因此能够以诊断能力来使用以鉴定病毒病原体的存在或不存在。由于lamp更加简单，因此其可使用更少的设备和样品制备来执行，并因此更容易在诊所、急诊室等即时医疗环境中使用，甚至可以在移动基础(mobile basis)上使用。

技术实现思路

1、本公开涉及用于使用lamp分析来检测目标核苷酸的技术(例如，组合物、方法、系统和组件)。在一些方面中，可知晓目标核苷酸存在于感兴趣的病原体中。在病原体是病毒的情况下，lamp分析可以是rt-lamp分析。

2、在一些公开实施方式中，提供制备供病原体目标的环介导等温扩增(lamp)检测的唾液样品的方法。一方面，这样的方法可包括提供来自测试对象的一定量的唾液，和在水中将唾液稀释至降低唾液的缓冲能力的程度，同时维持足够的浓度以允许病原体目标的检测。

3、一方面，方法可包括与原始粘度相比降低唾液的粘度。另一方面，可通过稀释、过滤或其组合中的一种或多种来降低粘度。另一方面，可使用过滤来降低粘度。在其它方面中，可使用10微米过滤器来降低粘度。又一方面，粘度可降低至与原始粘度相比增加通过固相介质的流动性的程度。又一方面，粘度可降低至约1.0厘泊(cp)至约50cp的范围。

4、一方面，这样的方法可包括将唾液样品过滤至使唾液样品ph调节至测试样品目标范围的程度。另一方面，测试样品目标范围可以是约7.2至约8.6。另一方面，水可具有大于6.0的ph并且可基本上不含污染物。又一方面，唾液样品可主要由唾液和水组成。又一方面，可使用海绵基采集来采集唾液。

5、一方面，可在水中将唾液稀释至唾液与水的比为约1:1至约1:20。另一方面，可在水中将唾液稀释至为样品提供在600nm处小于0.2的光密度(od600)的程度。在其它方面中，唾液的体积为约50μl至约100μl。又一方面，唾液样品的体积范围为约100μl至约1ml。

6、在其它方面中，病原体目标可包括病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或原生动物病原体。一方面，病原体目标可以是病毒目标。另一方面，病毒目标可包括dsdna病毒、ssdna病毒、dsrna病毒、正链ssrna病毒、负链ssrna病毒、ssrna-rt病毒或ds-dna-rt病毒。又一方面，病毒目标可以是h1n1、h2n2、h3n2、h1n1pdm09或sars-cov-2。

7、在一些方面中，lamp检测可包括逆转录lamp(rt-lamp)检测。

8、在其它公开实施方式中，公开用于lamp分析的测试样品组合物并且可包括：测试对象的足以经由lamp分析检测病原体目标的唾液量与降低唾液的缓冲能力的水量的组合。

9、一方面，组合物可具有约1.0cp至约50cp的粘度。另一方面，组合物可具有约7.2至约8.6的ph。另一方面，组合物的唾液与水的比可为约1:1至约1:20。又一方面，组合物可具有在600nm处小于0.2的光密度(od600)。另一方面，水可具有大于6.0的ph并且可基本上不含污染物。一方面，组合物可主要上由唾液和水组成。另一方面，唾液可具有范围从约50μl至约100μl的体积。又一方面，唾液样品可具有约100μl至约1ml的体积。

10、一方面，病原体目标可包括病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或原生动物病原体。另一方面，病原体目标可以是病毒目标。另一方面，病毒目标可包括dsdna病毒、ssdna病毒、dsrna病毒、正链ssrna病毒、负链ssrna病毒、ssrna-rt病毒或ds-dna-rt病毒。又一方面，病毒目标可包括h1n1、h2n2、h3n2、h1n1pdm09或sars-cov-2。又一方面，组合物的缓冲能力可小于5mm。

11、在又其它公开实施方式中，用于固相介质上lamp分析的组合物可包括一种或多种目标引物、dna聚合酶和再增溶剂(re-solubilization agent)。在一些方面中，这样的组合物可基本上不含能够使固相介质变色的非ph敏感剂。一方面，组合物可包括抗氧化剂。另一方面，组合物可基本上不含挥发性剂。又一方面，组合物可基本上不含吸湿剂。另一方面，组合物还可包括逆转录酶。

12、一方面，当在25℃下、在约40％与约90％相对湿度(rh)之间时，吸湿剂可吸收超过约10wt％。另一方面，吸湿剂可包括甘油、乙醇、甲醇、氯化钙、氯化钾、硫酸钙及其组合。

13、另一方面，再增溶剂可以是表面活性剂。另一方面，再增溶剂可包括牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白、聚山梨醇酯20或其组合。

14、一方面，目标引物可靶向病原体，所述病原体可包括病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或原生动物病原体。一方面，病原体可以是病毒病原体。另一方面，病毒病原体可包括dsdna病毒、ssdna病毒、dsrna病毒、正链ssrna病毒、负链ssrna病毒、ssrna-rt病毒或ds-dna-rt病毒。另一方面，病毒病原体可包括h1n1、h2n2、h3n2、h1n1pmd09或sars-cov-2。

15、一方面，组合物还可包括不变色添加剂。不变色添加剂可包括糖、缓冲剂或其组合中的一种或多种。另一方面，组合物还可包括指示剂。

16、在其它公开实施方式中，用于固相介质上lamp分析的方法可包括提供固相介质与本文叙述的组合物的组件，将生物样品沉积到固相介质上，和将组件加热至足以促进lamp反应的等温温度。一方面，生物样品可以是唾液、粘液、血液、尿液、粪便、汗液、呼出气冷凝物或其组合中的一种或多种。另一方面，生物样品是唾液。一方面，lamp分析可以是逆转录酶lamp(rt-lamp)。另一方面，方法还可包括检测病毒病原体。

17、在其它公开实施方式中，用于执行lamp分析的系统可包括本文叙述的组合物，和组合物沉积于其上的固相介质。

18、在又其它公开实施方式中，用于环介导等温扩增(lamp)分析的组合物可利用ph依赖性输出信号，所述组合物可包括ph敏感染料，和多种非干扰lamp试剂。一方面，lamp分析可以是rt-lamp。

19、一方面，ph敏感染料可以是酚红、酚酞、石蕊精、溴百里酚蓝、萘酚酞(naphtholphthalein)、甲酚红或其组合中的至少一种。另一方面，所述多种非干扰lamp试剂可基本上不含挥发性试剂、ph干扰试剂、镁干扰试剂或其组合。

20、一方面，所述多种非干扰lamp试剂可基本上不含镁、硫酸铵和碳酸铵。一方面，所述多种非干扰lamp试剂可包括dna聚合酶、逆转录酶、目标引物或其组合。

21、另一方面，组合物可包括抗氧化剂。另一方面，组合物还可包括载体rna、载体dna、rnase抑制剂、dnase抑制剂、盐酸胍或其组合。一方面，组合物还可包括固相介质。

22、一方面，组合物可包括不变色添加剂，所述不变色添加剂可包括糖、缓冲剂、阻断剂或其组合。一方面，糖可包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖或其组合中的一种或多种。另一方面，阻断剂可包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其组合。

23、在其它公开实施方式中，提供利用ph依赖性输出信号执行lamp分析的方法，并且其可包括提供固相介质与本文叙述的组合物的组件，将生物样品沉积到固相介质上，和将组件加热至足以促进lamp反应的等温温度。一方面，lamp分析可以是rt-lamp。一方面，生物样品可以是唾液、粘液、血液、尿液、粪便、汗液、呼出气冷凝物及其组合中的一种或多种。一方面，生物样品可以是唾液。另一方面，方法还可包括检测病毒病原体。

24、在进一步公开实施方式中，最大化ph依赖性lamp分析中输出信号的准确度的方法可包括提供最小化来自信号输出介质的非lamp反应产生的变色的试剂混合物，和执行lamp反应。一方面，方法可包括控制来自非lamp反应的质子的产生。另一方面，方法可包括控制来自非lamp反应的氧化。

25、在其它公开实施方式中，最大化ph依赖性lamp分析中输出信号的准确度的方法可包括基本上消除来自信号输出介质的非lamp反应产生的变色。

26、在其它公开实施方式中，最大化ph依赖性lamp分析中检测极限(lod)的方法可包括基本上消除来自信号输出介质的非lamp反应产生的变色。