结合CCR9的治疗性结合分子的制作方法

背景技术：

技术实现思路

0、3
技术实现要素：

1、诸位发明人已经发现趋化因子受体ccr9高度表达于患有ibd的患者的结肠和回肠中，在其中它与炎性细胞因子ifn-γ、il-4和il-17共表达。诸位发明人已经成功产生结合分子，这些结合分子结合ccr9表达细胞(ccr9-expressing cell)、抑制ccr9与其天然配体ccl25之间的相互作用并且防止ccl25介导的ccr9内化。有利地，结合分子可以诱导它们所结合的ccr9表达细胞的死亡，例如通过介导针对它们所结合的ccr9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)进行。开发抑制ccl25与ccr9的结合并且诱导它所结合的ccr9表达细胞的死亡的结合分子对于患有ibd的受试者是特别有利的。

2、因此，本发明涉及结合ccr9的结合分子。本发明结合分子优选地抑制ccl25与ccr9的结合。本发明结合分子优选地能够诱导它们所结合的ccr9表达细胞的死亡。例如，结合分子可以能够介导针对它们所结合的细胞的adcc应答。本发明结合分子优选地能够防止或抑制它们所结合的ccr9表达细胞的迁移。例如，这些结合分子可以防止ccr9表达细胞响应于ccl25的迁移，或者这些结合分子可以能够防止ccr9表达细胞从外周迁移至受试者的肠道中。

3、在一方面，本发明提供了一种结合分子，该结合分子结合ccr9并且包含具有一组cdr hcdr1、hcdr2和hcdr3的重链可变(vh)区和具有一组cdr lcdr1、lcdr2和lcdr3的轻链可变(vl)区，其中(a)vh区氨基酸序列包含seq id no:1的hcdr1、seq id no:2的hcdr2和seq id no:3的hcdr3，并且其中vl区氨基酸序列包含seq id no:4(rssqslvhx1nx2ntylh，其中x1和x2是任何氨基酸)的lcdr1、seq id no:5的lcdr2和seq id no:6的lcdr3；(b)vh区氨基酸序列包含seq id no:7的hcdr1、seq id no:8的hcdr2和seq id no:9的hcdr3，并且其中vl区氨基酸序列包含seq id no:10的lcdr1、seq id no:11的lcdr2和seq id no:12的lcdr3；或者(c)vh区氨基酸序列包含seq id no:13的hcdr1、seq id no:14的hcdr2和seqid no:15的hcdr3，并且其中vl区氨基酸序列包含seq id no:16的lcdr1、seq id no:17的lcdr2和seq id no:18的lcdr3；或者其中所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3中的任何一个或多个与所述序列相比包含1、2或3个氨基酸取代。

4、本发明结合分子可以包含vh区氨基酸序列，该vh区氨基酸序列含有seq id no:1的hcdr1、seq id no:2的hcdr2和seq id no:3的hcdr3；和vl区氨基酸序列，该vl区氨基酸序列含有seq id no:5的lcdr2和seq id no:6的lcdr3，以及具有选自以下的氨基酸序列的lcdr1：seq id no:4、seq id no:19(rssqslvhx1nx2ntylh，其中seq id no:19的x1是p或s并且seq id no:19的x2是r、t或g)、seq id no:20、seq id no:21和seq id no:22。

5、本发明结合分子优选地包含免疫球蛋白fc结构域或其保留结合一种或多种fc受体的能力的片段。例如，该结合分子可以包含人igg1fc结构域或其片段。本发明结合分子优选地是无岩藻糖基化的。例如，结合分子可以在氨基酸位置297处是无岩藻糖基化的。本发明结合分子可以以组合物存在，该组合物包含所述结合分子的多个拷贝，其中该组合物中该结合分子的这些拷贝中的至少50％、75％、90％、95％、98％、99％或100％是无岩藻糖基化的。

6、在另一方面，本发明提供了一种结合分子，该结合分子结合ccr9，其中该结合分子不与本发明的另一种结合分子竞争结合ccr9，诸如不与如上所述的结合分子竞争结合ccr9，诸如不与如本文描述用于在疗法中使用的结合分子竞争结合ccr9。此方面的结合分子可以用于确定已经与本发明结合分子接触的样品中ccr9+细胞的丰度。

7、类似地，本发明提供了一种评估本发明结合分子对ccr9表达细胞的耗尽的方法，该方法包括：(i)使所述结合分子在以下条件下与细胞群体接触，其中该细胞群体包含ccr9表达细胞和免疫效应细胞，这些条件适于允许这些效应细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；(ii)使所述细胞群体与结合ccr9并且不与步骤(i)的该结合分子竞争结合ccr9的结合分子接触；(iii)检测该细胞群体中被(ii)的该结合分子结合的ccr9表达细胞；(iv)将步骤(iii)中检测到的ccr9表达细胞的量与步骤(i)中使用的该原始细胞群体中ccr9表达细胞的量进行比较，并且从而确定在步骤(i)中耗尽的ccr9表达细胞的量。

8、本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码任一种本发明结合分子。还提供了一种载体，该载体包含与启动子可操作地缔合的本发明多核苷酸。还提供了一种载体，该载体包含编码本发明结合分子的vh区的多核苷酸和编码本发明结合分子的vl区的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一个或多个启动子可操作地缔合。

9、本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明多核苷酸或本发明载体。还提供了一种产生本发明结合分子的方法，该方法包括在宿主细胞中表达本发明多核苷酸或本发明载体。

10、本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明结合分子、和药学上可接受的载体或稀释剂。

11、本发明还涉及在医学中使用本发明结合分子，诸如用于在疗法中使用的本发明结合分子。本发明涉及通过包括以下的方法治疗受试者中的ccr9介导的疾病或病症：向该受试者施用有效量的本发明结合分子或本发明组合物。本发明还涉及通过包括以下的方法治疗受试者中的ccr9介导的疾病或病症：向该受试者施用有效量的结合ccr9的结合分子，其中所述结合分子能够(i)抑制ccl25与ccr9的结合；和(ii)介导针对它所结合的ccr9表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。

12、如本文所述的结合分子还可以用于检测ccr9。例如，本发明提供了一种用于检测样品中ccr9多肽的存在的方法，该方法包括：(a)

13、使样品与结合ccr9的结合分子诸如任一种本发明结合分子或如本文所述的结合分子接触，以提供结合分子-抗原复合物；(b)检测所述结合分子-抗原复合物的存在或不存在；(c)其中该结合分子-抗原复合物的存在确认了ccr9多肽的存在。

14、本发明涉及改善的抗ccr9抗体和在炎性肠病治疗中的用途。本发明特别地涉及特异性结合c-c基序趋化因子受体9(ccr9)的人源化无岩藻糖基化单克隆抗体。经由其fc受体功能性，该抗体与该ccr9受体的结合起始adcc应答，导致ccr9表达细胞群体的耗尽。本发明抗体是人源化的、cdr优化的。这些抗体是无岩藻糖基化的，而没有效力的任何丧失。

15、4附图说明

16、图1：各种细胞类型中的ccr9表达。

17、图1a：ccr9在来自食蟹猴和人细胞血液、肠系膜淋巴结(仅食蟹猴)、结肠、回肠和胸腺的cd4+细胞中的表达；图1b：ccr9在健康和ibd患者的回肠(左)和结肠(右)中的b细胞中的表达；图1c：ccr9在来自健康或ibd患者的结肠或回肠的t效应细胞和treg中的表达。

18、图2：在cd4+t细胞中ccr9与促炎细胞因子的关联性。

19、图2a：ccr9-和ccr9+细胞中的ifn-γ、il-4和il-17表达；图2b：在cd4+ccd9-细胞与cd4+ccr9+细胞之间图2a中评估的细胞因子的表达水平的倍数变化。

20、图3：九种抗ccr9抗体的可变区的比对氨基酸序列

21、图3a：vh区；图3b：vl区。cdr(hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的位置以下划线指示。也指示了框架(fw)区的位置。

22、图4：抗体ab1020243、该抗体的人源化形式(ab1020243-fgl)和抗体的两种cdr优化形式(243lo0326和243lo0331)的比对vh和vl区

23、图5：抗ccr9抗体与表达或不表达ccr9的细胞的结合

24、图5a：与molt 4细胞系的结合；图5b：与molt 4和jurkat细胞系的结合

25、图6：在hek细胞中ab1020243与不同形式的ccr9的结合

26、作为对照，在未用ccr9转染的hek细胞(亲本hek)中评估结合，并且然后还在过表达人ccr9a(hu a hek)、人ccr9b(hu b hek)、食蟹猴ccr9(cyno hek)、小鼠ccr9(小鼠hek)和大鼠ccr9(大鼠hek)的hek细胞中评估了结合。

27、图7：通过与表达ccr9a的hek细胞(顶部)或molt 4细胞(底部)一起预孵育的无岩藻糖基化抗ccr9抗体对nk细胞的激活。

28、图8：用抗ccr9抗体的处理对ccr9+cd4+pbmc的数量的影响。

29、图9：嵌合抗体ab1020243及其人源化形式与各种配体的结合的比较。

30、图9a：人ccr9b；图9b：食蟹猴ccr9；图9b：cxcr1；图9d：cxcr2；图9e：ccr5；图9f：ccr8；图9g：未用ccr9转染的hek细胞。

31、图10：ab1020243抗体与其人源化形式的比较

32、图10a：在结合molt 4细胞系之后的nk细胞激活；图10b：人源化和嵌合ab1020243无岩藻糖基化(afuc)抗体的动力学特性。

33、图11：抗ccr9抗体与ccl25竞争结合ccr9的能力。

34、图12：243lo0326和ab1020243与配体的结合

35、图12a：人ccr9a；图12b：人ccr9b；图12c：食蟹猴ccr9a；图12d：ccr5；图12e：ccr8；图12f：cxcr1；和图12f：cxcr2。

36、图13：随时间在细胞表面处结合的抗体ab1020243或抗体243lo0326的量

37、随时间在细胞表面处结合的抗体ab1020243或抗体243lo0326的量(图13a)和随时间抗体或ccl25治疗对细胞表面处的ccr9受体水平的影响(图13b)。

38、图14：抗ccr9抗体在杀伤molt 4细胞方面的作用

39、图14a：pbmc和jurkat细胞(图14b)；和人或食蟹猴pbmc(图14c)。

40、图15：岩藻糖基化对效力的影响

41、图15b：无岩藻糖基化对addc的影响。图15a：岩藻糖基化与无岩藻糖基化物质在岩藻糖基化加标研究中的adcc活性。rp：相对效力。

42、图16：ccr9+t细胞的靶向体内耗尽

43、图16a：243lo0326的静脉内注射对食蟹猴的血液中ccr9+记忆cd4+t细胞的数量的影响。图16b：高剂量和低剂量的243lo0326在2天内减少食蟹猴的外周血中的cdr4+ccr9+细胞。图16c：高剂量和低剂量的243lo0326降低食蟹猴的回肠中的cdr4+ccr9+细胞，如通过facs在第15天测量的。图16d：高剂量和低剂量的243lo0326降低食蟹猴的肠道粘膜中的cdr4+ccr9+细胞，如通过ihc在第15天测量的。

44、图17：ccr9+肠道淋巴细胞的选择性耗尽

45、图18：243lo0326对从ibd患者获取的人肠道外植体中的ibd标记物的影响。

46、图18a：ccr9水平；图18b：il-6水平；图18c：gm-csf水平；图18d：il-22水平。

47、图19：阻断ccr9内化

48、243lo0326抑制ccl25诱导的ccr9内化。

49、图20：ccr9a和ccr9b比对