用于高度多重定量PCR的循环多重分析的制作方法

本公开涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及可用于检测、扩增和定量核酸分子的方法和组合物。序列表的并入表1提供了本技术中使用的核酸序列。表1.核酸序列

背景技术：

1、多重定量聚合酶链反应(多重qpcr)是一种广泛接受的分子诊断技术，其用于检测和定量多个不同的dna靶标序列。在多重qpcr中，包含全部、部分或不含一组dna靶标的单个dna样品与一组pcr引物、一组荧光探针、dna聚合酶以及dna聚合酶发挥作用所需的缓冲剂和试剂混合。

2、在多重qpcr的众多实施方案中，所用的dna聚合酶具有5’至3’核酸外切酶活性，并且dna探针是探针的一端用荧光团功能化且探针的另一端用荧光猝灭剂功能化的taqmantm探针。在pcr扩增过程中，如果样品中最初存在dna靶标，则与dna靶标序列相对应的pcr扩增子的浓度将会增加。随着pcr扩增子的积累，扩增子与taqmantm探针结合，并导致探针上的磷酸二酯骨架水解。这种结合导致荧光团与荧光猝灭剂的离域，从而导致溶液荧光增强。

3、在多重qpcr中，通常，对应于不同dna靶标的taqmantm探针将使用光谱上不同的荧光团进行功能化，以便检测对应于特定dna靶标的存在的特定荧光信号。由于物理和化学性质的限制，光谱上能够被区分的荧光团数量有限；根据具体的荧光团和使用的仪器，该限制在5至10个荧光团之间。

4、对于肿瘤学和传染病综合症检测中的应用，存在超过20个相关的dna靶标序列。虽然在某些情况下可以将dna样品分成多个等分试样，每个等分试样经历不同的多重qpcr反应以检测一组不同的dna靶标，但实践中，这需要额外劳动力和更高的样品量要求，使得这种解决方案不受欢迎。因此，需要可以将可检测的dna靶标数量增加至超过光谱上不同的荧光团数量的方法。

技术实现思路

1、在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(b)任选地，所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)任选地，至少一个dna模板分子；(d)第一正向引物(fp1)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第一区域互补的序列；(e)第一探针(tp1)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(rp1)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第三区域同源的序列；(g)第二正向引物(fp2)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第四区域互补的序列；(h)第二封阻引物(b2)，其包含与所述至少一个dna模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述至少一个dna模板分子的所述第四区域5’侧的模板子序列部分互补的序列；(i)第二探针(tp2)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第五区域互补或同源的序列；(j)第二反向引物(rp2)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第六区域同源的序列，其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述tp1包含荧光团(tp1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp2包含荧光团(tp2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述tp1荧光团和所述tp2荧光团在光谱上彼此不同。

2、在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(b)任选地，所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)任选地，至少一个dna模板分子；(d)第一正向引物(fp1)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第三区域互补的序列；(e)第一探针(tp1)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(rp1)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第一区域同源的序列；(g)第二正向引物(fp2)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第五区域互补的序列；(h)第二封阻引物(b2)，其包含与所述至少一个dna模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述至少一个dna模板分子的所述第五区域5’侧的所述至少一个dna模板分子的子序列部分互补的序列；(i)第二探针(tp2)，其包含与所述至少一个dna模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个dna模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述tp1包含荧光团(tp1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp2包含荧光团(tp2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述tp1荧光团和所述tp2荧光团在光谱上彼此不同。

3、在一个方面，本公开提供了一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，该方法包含：(a)将包含dna模板分子的样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(ii)所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(fp1)，其包含与所述dna模板分子的第一区域互补的序列；(iv)第一探针(tp1)，其包含与所述dna模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(rp1)，其包含与所述dna模板分子的第三区域同源的序列；(vi)第二正向引物(fp2)，其包含与所述dna模板分子的第四区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(b2)，其包含与所述dna模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述dna模板分子的所述第四区域5’侧的所述dna模板分子的子序列部分互补的序列；(viii)第二探针(tp2)，其包含与所述dna模板分子的第五区域互补或同源的序列；和(ix)第二反向引物(rp2)，其包含与所述dna模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述tp1包含荧光团(tp1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp2包含荧光团(tp2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述tp1荧光团和所述tp2荧光团在光谱上彼此不同；和(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。

4、在一个方面，本公开提供了一种在水性溶液中产生荧光信号的方法，该方法包含：(a)将包含dna模板分子的样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(ii)所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(fp1)，其包含与所述dna模板分子的第三区域互补的序列；(iv)第一探针(tp1)，其包含与所述dna模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(rp1)，其包含与所述dna模板分子的第一区域同源的序列；(vi)第二正向引物(fp2)，其包含与所述dna模板分子的第五区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(b2)，其包含与所述dna模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述dna模板分子的所述第五区域5’侧的所述dna模板分子的子序列部分互补的序列；和(viii)第二探针(tp2)，其包含与所述dna模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个dna模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述tp1包含荧光团(tp1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp2包含荧光团(tp2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述tp1荧光团和所述tp2荧光团在光谱上彼此不同；和(b)使步骤(a)中的样品经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替。

5、在一个方面，本公开提供了一种检测样品中的dna模板序列的方法，该方法包含：(a)将样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(ii)所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(fp1)，其包含与所述dna模板分子的第一区域互补的序列；(iv)第一探针(tp1)，其包含与所述dna模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(rp1)，其包含与所述dna模板分子的第三区域同源的序列；(vi)第二正向引物(fp2)，其包含与所述dna模板分子的第四区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(b2)，其包含与所述dna模板分子的所述第四区域部分互补并且与位于所述dna模板分子的所述第四区域5’侧的所述dna模板分子的子序列部分互补的序列；(viii)第二探针(tp2)，其包含与所述dna模板分子的第五区域互补或同源的序列；(ix)第二反向引物(rp2)，其包含与所述dna模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述tp1包含荧光团(tp1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp2包含荧光团(tp2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述tp1荧光团和所述tp2荧光团在光谱上彼此不同；(b)使步骤(a)中的溶液经受至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在tp1和tp2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定tp1(ct1)和tp2(ct2)的循环阈值(ct)；(e)如果ct1小于35个循环，ct2小于50个循环，并且[ct2–ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述dna模板。

6、在一个方面，本公开提供了一种检测样品中的dna模板序列的方法，该方法包含：(a)将样品与以下混合以产生溶液：(i)具有5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(ii)所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)第一正向引物(fp1)，其包含与所述dna模板分子的第三区域互补的序列；(iv)第一探针(tp1)，其包含与所述dna模板分子的第二区域互补或同源的序列；(v)第一反向引物(rp1)，其包含与所述dna模板分子的第一区域同源的序列；(vi)第二正向引物(fp2)，其包含与所述dna模板分子的第五区域互补的序列；(vii)第二封阻引物(b2)，其包含与所述dna模板分子的所述第五区域部分互补并且与位于所述dna模板分子的所述第五区域5’侧的所述dna模板分子的子序列部分互补的序列；和(viii)第二探针(tp2)，其包含与所述dna模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个dna模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述tp1包含荧光团(tp1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp2包含荧光团(tp2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述tp1荧光团和所述tp2荧光团在光谱上彼此不同；(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在tp1和tp2对应的荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定tp1(ct1)和tp2(ct2)的循环阈值(ct)；和(e)如果ct1小于35个循环，ct2小于50个循环，并且[ct2–ct1]的值在1个循环和12个循环之间，则正向判定所述样品中存在所述dna模板。

7、在一个方面，本公开提供了一种用于检测分析物中的多个dna靶标的方法，该方法包含：(a)将分析物与以下混合以产生溶液：(i)具5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(ii)所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(iii)多个pcr引物；(iv)包含荧光团和荧光猝灭部分的多个探针；(b)使步骤(a)中的溶液经历至少7轮热循环，其中，任选地，每轮包括在等于或大于78℃的温度持续1秒至30分钟与低于75℃的温度持续1秒至4小时之间交替；(c)在至少两个荧光通道中测量步骤(b)中每轮热循环后所述溶液的荧光值；(d)确定所述至少两个荧光通道中每一个的循环阈值(ct)；(e)确定荧光信号增强的时间顺序；(f)将荧光信号增强的顺序映射到所述多个dna靶标的存在、不存在或数量。

8、在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(b)任选地，所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)任选地，dna模板分子；(d)第一正向引物(fp1)，其包含与所述dna模板分子的第一区域互补的序列；(e)第一探针(tp1)，其包含与所述dna模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(rp1)，其包含与所述dna模板分子的第三区域同源的序列；(g)第二正向引物(fp2)，其包含与所述dna模板分子的第四区域互补的序列，其中所述fp2在其3’端处或3’端附近包含与所述dna模板分子不互补的一个或多个核苷酸；(h)第二探针(tp2)，其包含与所述dna模板分子的第五区域互补或同源的序列；(i)第二反向引物(rp2)，其包含与所述dna模板分子的第六区域同源的序列；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域、所述第五区域和所述第六区域各自包含12至50个核苷酸；其中0至5000个核苷酸位于任意两个区域之间；其中所述tp1包含荧光团(tp1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp2包含荧光团(tp2荧光团)和荧光猝灭部分；并且其中所述tp1荧光团和所述tp2荧光团在光谱上彼此不同。

9、在一个方面，本公开提供了一种混合物或试剂盒，其包含：(a)任选地，具有5’至3’核酸外切酶活性的dna聚合酶；(b)任选地，所述dna聚合酶发挥作用所需的试剂和缓冲剂；(c)任选地，dna模板分子；(d)第一正向引物(fp1)，其包含与所述dna模板分子的第三区域互补的序列；(e)第一探针(tp1)，其包含与所述dna模板分子的第二区域互补或同源的序列；(f)第一反向引物(rp1)，其包含与所述dna模板分子的第一区域同源的序列；(g)第二正向引物(fp2)，其包含与所述dna模板分子的第五区域互补的序列，其中所述fp2在其3’端处或3’端附近包含与所述dna模板分子不互补的一个或多个核苷酸；和(h)第二探针(tp2)，其包含与所述dna模板分子的第四区域互补或同源的序列；其中所述至少一个dna模板分子按从5’至3’的顺序包含所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域不重叠；其中所述第一区域、所述第二区域、所述第三区域、所述第四区域和所述第五区域各自包含12至50个核苷酸；其中所述第一区域的最5’端核苷酸与所述第五区域的最3’端核苷酸之间的距离在100至3000个核苷酸之间；其中所述tp1包含荧光团(tp1荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp2包含荧光团(tp2荧光团)和荧光猝灭部分；其中所述tp1荧光团和所述tp2荧光团在光谱上彼此不同。