真核系统中环状多核糖核苷酸的产生的制作方法

背景技术：

1、环状多核糖核苷酸是多核糖核苷酸的一个亚类，以连续环的形式存在。内源性环状多核糖核苷酸在人体组织和细胞中普遍表达。大多数内源性环状多核糖核苷酸是通过反向剪接(backsplicing)产生的，并且主要发挥非编码作用。已提出将合成的环状多核糖核苷酸(包括编码蛋白质的环状多核糖核苷酸)用于各种治疗性应用和工程应用。需要产生、纯化、和使用环状多核糖核苷酸的方法。

技术实现思路

1、本披露提供了用于产生、纯化、和使用环状rna的组合物和方法。

2、在第一方面，本披露的特点在于用于使多核糖核苷酸环化的真核系统，该真核系统包含：(a)多核糖核苷酸(例如，线性多核糖核苷酸)，该多核糖核苷酸具有式5'-(a)-(b)-(c)-(d)-(e)-3'，其中：(a)包含5'自切割核酶；(b)包含5'退火区；(c)包含多核糖核苷酸负载物(cargo)；(d)包含3'退火区；并且(e)包含3'自切割核酶；以及(b)包含rna连接酶的真核细胞。该线性多核糖核苷酸可以包括例如在元件(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的任一者之外或之间的另外的元件。例如，元件(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)中的任一者可以通过间隔子序列隔开，如本文所述。

3、在另一方面，本披露提供了一种用于使多核糖核苷酸环化的真核系统，该真核系统包含：(a)多核糖核苷酸(例如，线性多核糖核苷酸)，该多核糖核苷酸包括以5'至3'方向可操作地连接的(a)、(b)、(c)、(d)和(e)：(a)5'自切割核酶；(b)5'退火区；(c)多核糖核苷酸负载物；(d)3'退火区；和(e)3'自切割核酶；以及(b)包含rna连接酶的真核细胞。该线性多核糖核苷酸可以包括例如在元件(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的任一者之外或之间的另外的元件。例如，元件(a)、(b)、(c)、(d)和/或(e)中的任一者可以通过间隔子序列隔开，如本文所述。

4、在另一方面，本披露提供了一种产生环状rna的方法，该方法包括在真核细胞中使(a)与(b)接触：(a)多核糖核苷酸(例如，线性多核糖核苷酸)，该多核糖核苷酸具有式5'-(a)-(b)-(c)-(d)-(e)-3'，其中：(a)包含5'自切割核酶；(b)包含5'退火区；(c)包含多核糖核苷酸负载物；(d)包含3'退火区；并且(e)包含3'自切割核酶；以及(b)rna连接酶。在一些实施例中，该5'自切割核酶的切割和该3'自切割核酶的切割产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该rna连接酶连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'端和3'端，从而产生环状rna。在一些实施例中，将该环状rna从真核细胞分离。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是内源的。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是异源的。

5、在另一方面，本披露提供了一种产生环状rna的方法，该方法包括在真核细胞中使(a)与(b)接触：(a)多核糖核苷酸(例如，线性多核糖核苷酸)，该多核糖核苷酸包括以5'至3'方向可操作地连接的(a)、(b)、(c)、(d)和(e)：(a)5'自切割核酶；(b)5'退火区；(c)多核糖核苷酸负载物；(d)3'退火区；和(e)3'自切割核酶；以及(b)rna连接酶。在一些实施例中，该5'自切割核酶的切割和该3'自切割核酶的切割产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该rna连接酶连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'端和3'端，从而产生环状rna。在一些实施例中，将该环状rna从真核细胞分离。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是内源的。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是异源的。

6、在另一方面，本披露提供了一种真核细胞，该真核细胞包含：(a)多核糖核苷酸(例如，线性多核糖核苷酸)，该多核糖核苷酸具有式5'-(a)-(b)-(c)-(d)-(e)-3'，其中：(a)包含5'自切割核酶；(b)包含5'退火区；(c)包含多核糖核苷酸负载物；(d)包含3'退火区；并且(e)包含3'自切割核酶；以及(b)rna连接酶。在一些实施例中，该5'自切割核酶的切割和该3'自切割核酶的切割产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该rna连接酶能够连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'端和3'端以产生环状rna。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是内源的。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是异源的。在一些实施例中，该真核细胞进一步包含环状rna。

7、在另一方面，本披露提供了一种真核细胞，该真核细胞包含：(a)多核糖核苷酸(例如，线性多核糖核苷酸)，该多核糖核苷酸包括以5'至3'方向可操作地连接的(a)、(b)、(c)、(d)和(e)：(a)5'自切割核酶；(b)5'退火区；(c)多核糖核苷酸负载物；(d)3'退火区；和(e)3'自切割核酶；以及(b)rna连接酶。在一些实施例中，该5'自切割核酶的切割和该3'自切割核酶的切割产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该rna连接酶能够连接该连接酶相容的线性多核糖核苷酸的5'端和3'端以产生环状rna。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是内源的。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是异源的。在一些实施例中，该真核细胞进一步包含环状rna。

8、在一些实施例中，该5'自切割核酶能够在位于该5'自切割核酶的3'端的10个核糖核苷酸内的位点处或在位于该5'自切割核酶的3'端的位点处进行自切割。

9、在一些实施例中，该5'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状(hammerhead)核酶、发夹状(hairpin)核酶、丁型肝炎病毒核酶(hdv)、varkud卫星(vs)核酶、glms核酶、扭转(twister)核酶、扭转姐妹(twister sister)核酶、斧头(hatchet)核酶和手枪(pistol)核酶。在一些实施例中，该5'自切割核酶是锤头状核酶。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括与seq id no:2的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的区域。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括seq id no:2的核酸序列。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括与seq id no:38-585中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核酸序列、或其对应的rna等同物、或其对应的rna等同物、或其有催化能力的片段。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括与seq id no:38-585中的任一者具有至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核酸序列、或其对应的rna等同物、或其有催化能力的片段。在一些实施例中，该5'自切割核酶包括seq id no:38-585中的任一者的核酸序列、或其对应的rna等同物、或其有催化能力的片段。

10、在一些实施例中，该3'自切割核酶能够在位于该3'自切割核酶的5'端的10个核糖核苷酸内的位点处或在位于该3'自切割核酶的5'端的位点处进行自切割。

11、在一些实施例中，该3'自切割核酶是选自以下的核酶：锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒核酶(hdv)、varkud卫星(vs)核酶、glms核酶、扭转核酶、扭转姐妹核酶、斧头核酶和手枪核酶。在一些实施例中，该3'自切割核酶是丁型肝炎病毒(hdv)核酶。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括与seq id no:13的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的区域。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括seq id no:13的核酸序列。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括与seq id no:38-585中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核酸序列、或其对应的rna等同物、或其有催化能力的片段。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括与seq id no:38-585中的任一者具有至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核酸序列、或其对应的rna等同物、或其有催化能力的片段。在一些实施例中，该3'自切割核酶包括seq id no:38-585中的任一者的核酸序列、或其对应的rna等同物、或其有催化能力的片段。

12、在一些实施例中，该5'自切割核酶和该3'自切割核酶产生连接酶相容的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，该5'自切割核酶的切割产生游离的5'-羟基基团，并且3'自切割核酶的切割产生游离的2',3'-环磷酸基团。

13、在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％的序列同一性。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶来自相同的自切割核酶家族。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享100％的序列同一性。

14、在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶共享低于100％、99％、95％、90％、85％、或80％的序列同一性。在一些实施例中，该5'和3'自切割核酶并非来自相同的自切割核酶家族。

15、在一些实施例中，该5'退火区具有2至100个核糖核苷酸(例如，2至100、2至80、2至50、2至30、2至20、5至100、5至80、5至50、5至30、5至20、10至100、10至80、10至50、或10至30个核糖核苷酸)。在一些实施例中，该3'退火区具有2至100个核糖核苷酸(例如，2至100、2至80、2至50、2至30、2至20、5至100、5至80、5至50、5至30、5至20、10至100、10至80、10至50、或10至30个核糖核苷酸)。

16、在一些实施例中，该5'退火区和该3'退火区各自包括互补区(例如，形成一对互补区)。在一些实施例中，该5'退火区包括具有在2与50个之间的核糖核苷酸(例如，2-40、2-30、2-20、2-10、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)的5'互补区；并且该3'退火区包括具有在2与50个之间的核糖核苷酸(例如，2-40、2-30、2-20、2-10、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)的3'互补区。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有在50％与100％之间的序列互补性(例如，在60％-100％、70％-100％、80％-100％、90％-100％之间、或100％的序列互补性)。

17、在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有低于-5kcal/mol(例如，低于-10kcal/mol、低于-20kcal/mol、或低于-30kcal/mol)的结合自由能。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少30℃、至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、或至少90℃的结合tm。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区包括不多于10个错配，例如10、9、8、7、6、5、4、3、或2个错配，或1个错配。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区不包括任何错配。

18、在一些实施例中，该5'退火区和该3'退火区各自包括非互补区。在一些实施例中，该5'退火区进一步包括具有在2与50个之间的核糖核苷酸(例如，2-40、2-30、2-20、2-10、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)的5'非互补区。在一些实施例中，该3'退火区进一步包括具有在2与50个之间的核糖核苷酸(例如，2-40、2-30、2-20、2-10、5-40、5-30、5-20、5-10、10-50、10-40、10-30、10-20、或20-50个核糖核苷酸)的3'非互补区。在一些实施例中，该5'非互补区位于该5'互补区的5'(例如，在该5'自切割核酶与该5'互补区之间)。在一些实施例中，该3'非互补区位于该3'互补区的3'(例如，在该3'互补区与该3'自切割核酶之间)。在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区具有在0％与50％之间的序列互补性(例如，在0％-40％、0％-30％、0％-20％、0％-10％之间、或0％的序列互补性)。在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区具有大于-5kcal/mol的结合自由能。在一些实施例中，该5'互补区和该3'互补区具有低于10℃的结合tm。在一些实施例中，该5'非互补区和该3'非互补区包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个错配。在一些实施例中，该5'退火区和该3'退火区不包括任何非互补区。

19、在实施例中，该5'退火区和该3'退火区具有高gc百分比(计算为gc核苷酸的数目除以总核苷酸、乘以100)，即其中相对大量的gc对参与在该5'退火区与该3'退火区之间的退火，例如，其中该gc百分比为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或甚至约100％。例如，在其中5'和3'退火区短(例如，其中每个退火区的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸)的实施例中，退火区中增加的gc百分比将增加两个区域之间的退火强度。在一些实施例中，该5'退火区包括与seq id no:4的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的区域。在一些实施例中，该5'退火区包括seq id no:4的核酸序列。在一些实施例中，该3'退火区包括与seq id no:12的核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的区域。在一些实施例中，该3'退火区包括seq id no:12的核酸序列。

20、在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括编码序列、或包含非编码序列、或包含编码序列和非编码序列的组合。在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括两个或更多个编码序列(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个编码序列)、两个或更多个非编码序列(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个非编码序列)、或其组合。在该多核糖核苷酸负载物包括两个或更多个编码序列的情况下，该编码序列可以是单个编码序列的两个或更多个拷贝、或者两个或更多个不同的编码序列中的每个编码序列的至少一个拷贝。在该多核糖核苷酸负载物包括两个或更多个非编码序列的情况下，该非编码序列可以是单个非编码序列的两个或更多个拷贝、或者两个或更多个不同的非编码序列中的每个非编码序列的至少一个拷贝。在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括至少一个编码序列和至少一个非编码序列。

21、在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包含至少一个非编码rna序列。在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列包含至少一个选自由以下组成的组的rna：rna适配体、长非编码rna(lncrna)、转移rna衍生的片段(trf)、转移rna(trna)、核糖体rna(rrna)、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)、和piwi相互作用rna(pirna)；或这些rna中的任一者的片段。在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列包含调节rna。在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列反式调节靶序列。

22、在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列对靶序列的反式调节是靶序列表达的上调。在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列对靶序列的反式调节是靶序列表达的下调。在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列对靶序列的反式调节是靶序列的可诱导表达。例如，该至少一个非编码rna序列可以通过环境条件(例如，光、温度、水或营养可用性)、通过昼夜节律、通过内源性或外源性提供的诱导剂(例如，小rna、配体)进行诱导。在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列可被真核系统的生理状态(例如，生长期、转录调节状态、和细胞内代谢物浓度)诱导。例如，可以提供外源性提供的配体(例如，阿拉伯糖、鼠李糖、或iptg)以使用诱导型启动子(例如，pbad、prha、和lacuv5)诱导表达。

23、在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列包含选自由以下组成的组的rna：小干扰rna(sirna)或其前体、双链rna(dsrna)或至少部分双链rna[例如，包含一个或多个茎环的rna]；发夹rna(hprna)、微小rna(mirna)或其前体[例如，pre-mirna或pri-mirna]；相位小干扰rna(phasirna)或其前体；异染色质小干扰rna(hcsirna)或其前体；以及天然反义短干扰rna(natsirna)或其前体。

24、在一些实施例中，该至少一个非编码rna序列包含指导rna(grna)或其前体。

25、在一些实施例中，靶序列包含受试基因组的基因的核苷酸序列。在一些实施例中，受试基因组是脊椎动物、无脊椎动物、真菌、卵菌、植物、或微生物的基因组。在一些实施例中，受试基因组是人、非人哺乳动物、爬行动物、鸟、两栖动物、或鱼的基因组。在一些实施例中，受试基因组是昆虫、蛛形纲、线虫、或软体动物的基因组。在一些实施例中，受试基因组是单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、或真核藻类的基因组。在一些实施例中，受试基因组是细菌、真菌、卵菌、或古细菌的基因组。在一些实施例中，靶序列包含在多个受试基因组中(例如，在给定属内的多个物种的基因组中)发现的基因的核苷酸序列。

26、在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包含编码多肽的编码序列。在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括与编码多肽的编码序列可操作地连接的ires。在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包含与编码多肽的表达序列可操作地连接的科扎克(kozak)序列。在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包含编码对受试者具有生物学作用的多肽的rna序列。在一些实施例中，该多肽是例如用于人或非人动物的治疗性多肽。在一些实施例中，该多肽是具有在脊椎动物(例如，非人哺乳动物、爬行动物、鸟、两栖动物、或鱼)、无脊椎动物(例如，昆虫、蛛形纲(arachnid)、线虫(nematode)、或软体动物)、植物(例如，单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、真核藻类)、或微生物(例如，细菌、真菌、古细菌、卵菌)的基因组中编码的序列的多肽。在一些实施例中，当与脊椎动物、无脊椎动物、或植物接触时，或当与脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、微生物细胞、或植物细胞接触时，该多肽具有生物学作用。在一些实施例中，该多肽是植物修饰多肽。在一些实施例中，当与以下各者接触时，该多肽提高脊椎动物、无脊椎动物、或植物的适应度，或提高脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、微生物细胞、或植物细胞的适应度。在一些实施例中，当与以下各者接触时，该多肽降低脊椎动物、无脊椎动物、或植物的适应度，或降低脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、微生物细胞、或植物细胞的适应度。

27、在一些实施例中，该多核糖核苷酸负载物包含编码多肽并且具有经密码子优化用于在受试者或生物体中表达的核苷酸序列的rna序列。用于在特定类型的生物体中表达的密码子优化的方法是本领域已知的并且作为商业载体或多肽设计服务的一部分提供。参见例如，美国专利号6,180,774(用于在单子叶植物中表达)、7,741,118(用于在双子叶植物中表达)、以及5,786,464和6,114,148(两者均用于在哺乳动物中表达)中描述的密码子优化的方法，将所有这些专利都通过引用以其全文并入本文。密码子优化可以使用几种公开获得的工具中的任一种来执行，例如，在例如以下中提供的多种密码子优化工具：www[dot]idtdna[dot]com/pages/tools/codon-optimization-tool；www[dot]novoprolabs[dot]com/tools/codon-optimization、en[dot]vectorbuilder[dot]com/tool/codon-optimization[dot]html，其中用于受试者的适当的属的密码子使用表可从门户网站下拉菜单中选择。

28、在一些实施例中，受试者包含(a)真核细胞；或(b)原核细胞。此类细胞的实施例包括永生化细胞系和原代细胞系。实施例包括位于组织、器官、或完整多细胞生物体内的细胞。例如，在实施例中，将如在本披露中所述的环状多核糖核苷酸(或含有该环状多核糖核苷酸的真核细胞)以靶向方式递送至多细胞生物体中的一个或多个特定细胞、组织、或器官。

29、在一些实施例中，受试者包括脊椎动物、无脊椎动物、真菌、卵菌、植物、或微生物。在一些实施例中，该脊椎动物选自人、非人哺乳动物(例如，小家鼠(mus musculus))、爬行动物(例如，安乐蜥(anolis carolinensis))、鸟(例如，家鸡(gallus domesticus))、两栖动物(例如，热带爪蟾(xenopus tropicalis))、或鱼(例如，danio rerio(斑马鱼))。在一些实施例中，该无脊椎动物选自昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫(leptinotarsadecemlineata))、蛛形纲(例如，中东金蝎(scorpio maurus))、线虫(例如，南方根结线虫(meloidogyne incognita))、或软体动物(例如，散斑角蜗牛(cornu aspersum))。在一些实施例中，该植物选自单子叶植物(例如，玉蜀黍(zea mays))、双子叶植物(例如，橹豆(glycine max))、裸子植物(例如，北美乔松(pinus strobus))、或真核藻类(例如，棒叶蕨藻(caulerpa sertularioides))。在一些实施例中，该微生物选自细菌(例如，大肠杆菌(escherichia coli))、真菌(例如，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris))、卵菌(例如，寡雄腐霉(pythium oligandrum)、致病疫霉(phytophthora infestans)和其他疫霉属物种(phytophthora spp.))、或古细菌(例如，激烈火球菌(pyrococcus furiosus))。

30、在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸进一步包括在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为至少5个多核糖核苷酸的间隔子区。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸进一步包括在该5'退火区与该多核糖核苷酸负载物之间的、长度为在5与1000个之间的多核糖核苷酸的间隔子区。在一些实施例中，间隔子区包括聚a序列。在一些实施例中，间隔子区包括聚a-c序列。

31、在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸是至少1kb。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸是1kb至20kb。在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸是100至约20,000个核苷酸。在一些实施例中，该线性rna的大小是至少100、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000个核苷酸。

32、在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是内源的(例如，该rna连接酶在该细胞中天然存在)。在一些实施例中，该rna连接酶对于该真核细胞是异源的(例如，该rna连接酶在该细胞中不是天然存在的，例如，该细胞已被基因工程化以表达或过表达该rna连接酶)。在一些实施例中，通过在真核细胞中将外源多核苷酸转录成编码该rna连接酶的mrna、并翻译编码该rna连接酶的mrna，向该真核细胞提供该rna连接酶。在一些实施例中，向该真核细胞提供作为外源性蛋白的rna连接酶(例如，使该rna连接酶在细胞外表达并向该细胞提供)。

33、在一些实施例中，该rna连接酶是trna连接酶。在一些实施例中，该trna连接酶是t4连接酶、rtcb连接酶、trl-1连接酶、rnl1连接酶、rnl2连接酶、lig1连接酶、lig2连接酶、pnk/pnl连接酶、pf0027连接酶、thpr ligt连接酶、ytlpor连接酶、或其变体。

34、在一些实施例中，该rna连接酶包含选自由seq id no:586-602组成的组的氨基酸序列。

35、在一些实施例中，该rna连接酶选自由以下组成的组：植物rna连接酶、质体(例如，叶绿体)rna连接酶、来自古细菌的rna连接酶、细菌rna连接酶、真核rna连接酶、病毒rna连接酶、或线粒体rna连接酶、或其变体。

36、在一些实施例中，该线性多核糖核苷酸是从脱氧核糖核酸转录的，该脱氧核糖核酸包括与编码本文所述的线性多核糖核苷酸的序列可操作地连接的rna聚合酶启动子。在一些实施例中，该rna聚合酶启动子与编码该线性多核糖核苷酸的序列是异源的。在一些实施例中，该rna聚合酶启动子是t7启动子、t6启动子、t4启动子、t3启动子、sp3启动子、sp6启动子、camv 35s、冠瘿碱(opine)启动子、植物泛素启动子、水稻肌动蛋白1启动子、adh-1启动子、gpd启动子、cmv启动子、ef1α启动子、cag启动子、pgk启动子、u6核启动子、tre启动子、opie2启动子、或opie1启动子。在一些实施例中，该rna聚合酶启动子提供编码线性多核苷酸的序列的表达的特异性；例如，可以选择启动子以提供细胞、组织、或器官特异性表达、时间特异性表达(例如，对昼夜节律、细胞周期、或季节性具有特异性)、或发育特异性表达。在一些实施例中，该rna聚合酶启动子是植物小rna或微小rna基因的启动子或动物小rna或微小rna基因的启动子；参见例如，美国专利号9,976,152和7,786,351；de rie(2017)naturebiotechnol.[自然生物技术],35:872-878。在本文所述的任何方面的一些实施例中，本披露提供了一种用于使多核糖核苷酸环化的真核系统，该真核系统包含：(a)编码本文所述的线性多核糖核苷酸的多脱氧核糖核苷酸(例如，cdna、环状dna载体、或线性dna载体)，以及(b)包含rna连接酶的真核细胞。

37、在一些实施例中，向该真核细胞提供包含该线性多核苷酸的外源性多核糖核苷酸。在一些实施例中，在该真核细胞中将该线性多核糖核苷酸从向该真核细胞提供的外源性重组dna分子瞬时转录。在一些实施例中，在该真核细胞中将该线性多核糖核苷酸从向该真核细胞提供的外源性dna分子转录。在一些实施例中，该外源性dna分子不整合到该真核细胞的基因组中。在一些实施例中，该外源性dna分子包含与编码该线性多核糖核苷酸的dna可操作地连接的异源性启动子。在一些实施例中，该异源性启动子选自由以下组成的组：t7启动子、t6启动子、t4启动子、t3启动子、sp3启动子、sp6启动子、camv 35s、冠瘿碱启动子、植物泛素启动子、水稻肌动蛋白1启动子、adh-1启动子、gpd启动子、cmv启动子、ef1α启动子、cag启动子、pgk启动子、u6核启动子、tre启动子、opie2启动子、或opie1启动子。在一些实施例中，在该真核细胞中将线性多核糖核苷酸从并入该真核细胞的基因组中的重组dna分子转录。

38、在一些实施例中，该真核细胞在培养基中生长。在一些实施例中，生物反应器中含有真核细胞。

39、在一些实施例中，该真核细胞是单细胞真核细胞。在一些实施例中，该单细胞真核细胞选自由以下组成的组：单细胞真菌细胞、单细胞动物细胞、单细胞植物细胞、单细胞藻类细胞、卵菌细胞、原生生物细胞、和原生动物细胞。在实施例中，该真核细胞是多细胞真核生物的细胞。在一些实施例中，该多细胞真核生物选自由以下组成的组：脊椎动物、无脊椎动物、多细胞真菌、多细胞卵菌、多细胞藻类、和多细胞植物。

40、在另一方面，本披露提供了一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸通过本文所述的真核系统或包括真核系统的任何方法产生。

41、在另一方面，本披露提供了一种通过向受试者提供本文所述的组合物或配制品来改良该受试者的方法。在一些实施例中，该组合物或配制品是核酸分子或包括核酸分子(例如，本文所述的dna分子或rna分子)，并且向真核受试者提供该核酸分子。在一些实施例中，该组合物或配制品是本文所述的真核细胞、或包括本文所述的真核细胞。

42、在另一方面，本披露提供了一种通过向有需要的受试者提供本文所述的组合物或配制品治疗该受试者的病症的方法。在一些实施例中，该组合物或配制品是核酸分子或包括核酸分子(例如，本文所述的dna分子或rna分子)，并且向真核受试者提供该核酸分子。在一些实施例中，该组合物或配制品是本文所述的真核细胞或包括本文所述的真核细胞。

43、在另一方面，本披露提供了一种通过向受试者提供本文所述的真核细胞而向该受试者提供环状多核糖核苷酸的方法。

44、在另一方面，本披露提供了一种配制品，该配制品包含本文所述的真核系统、真核细胞、或多核糖核苷酸。在一些实施例中，该配制品是药物配制品、兽用配制品、或农业配制品。

45、在另一方面，本披露提供了一种配制品，该配制品包含本文所述的真核细胞。在一些实施例中，该真核细胞是干燥的或冷冻的。在一些实施例中，该配制品是药物配制品、兽用配制品、或农业配制品。

46、定义

47、为了有助于对本披露的理解，下面定义了多个术语。本文定义的术语具有如与本披露相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一个/种(a、an)”和“该”并不旨在仅指单个实体，而是包括可以使用特定实例来说明的一般类别。术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指替代物或者替代物相互排斥，尽管本披露支持仅指替代物和“和/或”的定义。

48、本文的术语用于描述特定的实施例，但它们的使用不应被视为限制，除非在权利要求中列出。

49、如本文使用的，在值的范围内提供的任何值都包括上限和下限、以及该上限和下限内含有的任何值。

50、如本文使用的，术语“circrna”或“环状多核糖核苷酸”或“环状rna”或“环状多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有没有游离端(即，没有游离3'和/或5'端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸分子。

51、如本文使用的，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其非环状起始材料的测量。

52、词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”应理解为是指本身适合于所指示的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产物等。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”作为优选的实施例额外地披露了这种化合物、组合物、产物等用于治疗、调节等。

53、词语“用于……的化合物、组合物、产品等”或“化合物、组合物、产品等在制造用于……的药物、药物组合物、兽用组合物、诊断组合物等中的用途”指示此类化合物、组合物、产品等将用于可在人体或动物体上实施的治疗性方法中。它们被认为是涉及治疗方法等的实施例和权利要求的等同披露。如果实施例或权利要求因此是指“用于治疗疑似患有疾病的人或动物的化合物”，则这也被认为是披露“化合物在制造用于治疗疑似患有疾病的人或动物的药物中的用途”或“通过向疑似患有疾病的人或动物施用化合物的治疗方法”。

54、如本文使用的，术语“疾病”、“障碍”和“病症”各自指亚健康状态，例如，典型地被或将会被医疗专业人员诊断或治疗的状态。

55、“异源”意指发生在与天然存在的(天然的)背景不同的背景中。“异源”多核苷酸序列指示多核苷酸序列以在该序列的天然基因组中发现的方式不同的方式使用。例如，“异源启动子”用于驱动序列的转录，该序列不是由该启动子天然转录的序列；因此，“异源启动子”序列通常通过重组核酸技术包括在表达构建体中。术语“异源”也用于指被置于与另一序列的非天然存在的关系中的给定序列；例如，异源编码或非编码核苷酸序列通常通过基因组转化技术被插入基因组中，产生经基因修饰的基因组或重组基因组。

56、如本文使用的，“提高受试者的适应度”或“促进受试者的适应度”是指由于施用本文所述的肽或多肽而产生的生理学的或受试生物体进行的任何活动的任何有利的改变，包括但不限于以下所希望效果中的任何一种或多种：(1)使对生物或非生物应激的耐受性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使产率或生物量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使开花时间调整约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使对有害生物或病原体的抗性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，(4)使对除草剂的抗性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使受试生物体(例如，农业上重要的昆虫)的群体增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(6)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的繁殖速率提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(7)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的迁移提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(8)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的体重增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(9)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的代谢速率或活性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(10)使通过受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)进行的授粉(例如，在给定时间内被授粉的植物数量)提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(11)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)副产物(例如，来自蜜蜂的蜂蜜或来自蚕的蚕丝)的产量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(12)使受试生物体(例如，昆虫)的营养物(例如，蛋白质、脂肪酸、或氨基酸)含量提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(13)使受试生物体对杀有害生物剂(例如，新烟碱(例如，吡虫啉)或有机磷杀昆虫剂(例如，硫代磷酸酯，例如，杀螟硫磷))的抗性提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，(14)使受试生物体(如人或非人动物)的健康提高或使受试生物体(如人或非人动物)的疾病减少。相比于未施用调节剂的受试生物体，可以确定宿主适应度的提高。相反地，“降低受试者的适应度”是指由于施用本文所述的肽或多肽而产生的生理学的或受试生物体进行的任何活动的任何不利的改变，包括但不限于以下预期效果中的任何一种或多种：(1)使对生物或非生物应激的耐受性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使产率或生物量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使开花时间调整约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使对有害生物或病原体的抗性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，(4)使对除草剂的抗性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使受试生物体(例如，农业上重要的昆虫)的群体减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(6)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的繁殖速率降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(7)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的迁移降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(8)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的体重减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(9)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)的代谢速率或活性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(10)使通过受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)进行的授粉(例如，在给定时间内被授粉的植物数量)降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(11)使受试生物体(例如，昆虫，例如，蜂或蚕)副产物(例如，来自蜜蜂的蜂蜜或来自蚕的蚕丝)的产量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(12)使受试生物体(例如，昆虫)的营养物(例如，蛋白、脂肪酸、或氨基酸)含量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(13)使受试生物体对杀有害生物剂(例如，新烟碱(例如，吡虫啉)或有机磷杀昆虫剂(例如，硫代磷酸酯，例如，杀螟硫磷))的抗性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，(14)使受试生物体(如人或非人动物)的健康降低或使受试生物体(如人或非人动物)的疾病减少。相比于未施用调节剂的受试生物体，可以确定宿主适应度的降低。对本领域技术人员而言将显而易见的是，受试者的生理学、表型、或活性的某些变化(例如，植物开花时间的调整)可以被认为提高该受试者的适应度或降低该受试者的适应度，这取决于背景(例如，以适应气候或其他环境条件的变化)。例如，开花时间的延迟(例如，在给定日历日期开花的群体中的植物减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％)可以是对较晚或较凉的春季的有益适应，并因此被认为提高植物的适应度；相反，在春季较早或较暖的背景下，相同的开花时间的延迟可以被认为会降低植物的适应度。

57、如本文使用的，术语“线性rna”或“线性多核糖核苷酸”或“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有5'和3'端的多核糖核苷酸分子。5'和3'端中的一者或两者可以是游离端或接合至另一个部分。线性rna包括未经历环化(例如，经预环化)并可用作环化的起始材料的rna。

58、如本文使用的，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有至少一个针对糖、核碱基、或核苷间键的修饰的核苷酸。

59、术语“药物组合物”旨在同样披露包括在药物组合物中的环状或线性多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。

60、如本文使用的，术语“多核苷酸”意指包括一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子，并且可以与“核酸”或“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可以包括一个或多个选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸(po3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或rna可以指包括经由磷酸二酯键聚合的多个核糖核苷酸的大分子。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。

61、如本文使用的，本文的术语“多核糖核苷酸负载物”包括含有至少一个多核糖核苷酸的任何序列。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括一个或多个编码序列，其中每个编码序列编码多肽。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个非编码序列，如具有调节或催化功能的多核糖核苷酸。在实施例中，该多核糖核苷酸负载物包括编码序列和非编码序列的组合。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个本文所述的多核糖核苷酸序列，如一个或多个调节元件、内部核糖体进入位点(ires)元件、和/或间隔子序列。

62、如本文使用的，如果核酸构建体或载体的元件位于该构建体或载体上使得它们能够执行其功能(例如，促进转录或终止转录)，则它们是“可操作地连接的(operablyconnected或operably linked)”。例如，包括与编码线性前体rna的dna序列可操作地连接的启动子的dna构建体指示该编码线性前体rna的dna序列可以被转录以形成线性前体rna，例如，然后可以使用本文提供的方法环化成环状rna的线性前体rna。

63、多脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核酸或dna意指包括经由磷酸二酯键聚合的多个脱氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可检测标签(如发光标签)或标志物(例如，荧光团)的脱氧核糖核苷多磷酸，如例如脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、尿苷三磷酸(dutp)和脱氧胸苷三磷酸(dttp)dntp。核苷酸可以包括可以掺入正在生长的核酸链中的任何亚基。这种亚基可以是a、c、g、t或u，或对一个或多个互补a、c、g、t或u有特异性或与嘌呤(即，a或g或其变体)或嘧啶(即，c、t或u或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或其衍生物或变体。在一些情况下，仅举数例，多核苷酸是短干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、质粒dna(pdna)、短发夹rna(shrna)、小核rna(snrna)、信使rna(mrna)、前体mrna(pre-mrna)、反义rna(asrna)，并且涵盖核苷酸序列及其任何结构实施例，如单链、双链、三链、螺旋、发夹等。在一些情况下，多核苷酸分子是环状的。多核苷酸可以具有各种长度。核酸分子可以具有至少约10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更大的长度。可以从细胞或组织中分离多核苷酸。多核苷酸序列的实施例包括分离和纯化的dna/rna分子、合成的dna/rna分子和合成的dna/rna类似物。

64、多核苷酸(例如多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸)的实施例包括含有一种或多种核苷酸变体的多核苷酸，这些核苷酸变体包括一个或多个非标准核苷酸、一个或多个非天然核苷酸、一个或多个核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基辨苷(galactosylqueosine)、肌苷、n6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-d46-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸在其磷酸部分中包括修饰，包括对三磷酸部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括较大长度的磷酸链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸部分的磷酸链)和具有硫醇部分的修饰(例如，α-硫代三磷酸和β-硫代三磷酸)。在实施例中，核酸分子在碱基部分(例如，在典型地可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在典型地不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。在实施例中，核酸分子含有胺修饰的基团，如氨基烯丙基1-dutp(aa-dutp)和氨基己基丙烯酰胺-dctp(aha-dctp)，以允许共价附接胺反应性部分，如n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)。本披露的寡核苷酸中的标准dna碱基对或rna碱基对的替代物可以提供更高的位/立方mm密度，更高的安全性(抵抗天然毒素的意外或有目的的合成)，光编程聚合酶的更容易区分，或更低的二级结构。在betz k,malyshev da,lavergne t,welte w,diederichs k,dwyer tj,ordoukhanian p,romesbergfe,marx a.nat.chem.biol.[自然-化学生物学]2012年7月；8(7):612-4中描述了与用于从头和/或扩增合成的天然和突变体聚合酶相容的此类替代性碱基对，该文献出于所有目的通过引用并入本文中。

65、如本文使用的，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文使用的，该术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽可以包括基因产物、天然存在的多肽、合成的多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述物质的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包括单链或多链多肽(如抗体或胰岛素)，并且可以是缔合的或连接的。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。

66、如本文使用的，“前体线性多核糖核苷酸”或“前体线性rna”是指通过在真核系统中转录(例如，体内转录)(例如，从本文提供的多脱氧核糖核苷酸模板)创建的线性rna分子。前体线性rna是一种或多种自切割核酶切割之前的线性rna。在一种或多种自切割核酶切割后，线性rna被称为“连接酶相容的线性多核糖核苷酸”或“连接酶相容的rna”。

67、如本文使用的，术语“植物修饰多肽”是指能以导致植物适应度提高或降低的方式改变植物的遗传特性(例如，增加基因表达、减少基因表达或以其他方式改变dna或rna的核苷酸序列)、表观遗传特性、或生物化学或生理特性的多肽。

68、如本文使用的，术语“调节元件”是修饰与其可操作地连接的核酸序列的表达或转录的部分，如核酸序列。调节元件包括启动子、转录因子识别位点、终止子元件、小rna识别位点(小rna(例如微小rna)与其结合并进行切割)、和转录稳定元件(参见例如，美国专利申请公开2007/0011761中描述的稳定元件)。例如，在实施例中，调节元件(如启动子)修饰环状或线性多核糖核苷酸内编码或非编码序列的表达。在另一实施例中，调节元件(如小rna识别和切割位点)修饰rna转录物的表达，例如通过限制其在特定细胞、组织、或器官中的表达(参见例如，美国专利号8,334,430和9,139,838)。

69、如本文使用的，术语“rna等同物”是指rna序列，该rna序列是dna序列的rna等同物。因此，dna序列的rna等同物是指其中每个胸苷(t)残基被尿苷(u)残基替代的dna序列。例如，本披露提供了通过生物信息学方法鉴定的核酶的dna序列。本披露特别考虑了这些dna序列中的任何一个dna序列都可以转化为对应的rna序列并包括在本文所述的rna分子中。

70、如本文使用的，术语“序列同一性”是通过使用全局或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定的。当序列在最佳比对时(例如，当通过程序(如gap或bestfit)使用默认参数进行比对时)共享至少某个最小百分比的序列同一性时，这些序列被称为“基本上相同的”或“基本上相似的”。gap使用needleman和wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上对其进行比对，从而最大程度地增加了匹配数目并最大程度地减少了空位数目。通常，使用gap默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，而对于蛋白质，默认评分矩阵是blosum62(henikoff和henikoff,1992,pnas[美国科学院院报]89,915-919)。序列比对和百分比序列同一性的评分例如使用计算机程序来确定，这些计算机程序如从美国92121-3752加州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的阿赛乐德公司(accelrys inc.,9685scranton road,san diego,ca)获得的gcg wisconsin软件包10.3版或embosswin2.10.0版(使用程序“needle”)。可替代地或额外地，通过例如使用如fasta、blast等算法对数据库进行搜索来确定同一性百分比。序列同一性是指在序列的整个长度上的序列同一性。

71、如本文使用的，关于rna，“结构化”是指由rnafold软件或类似预测工具预测与其自身或相同rna分子中的其他序列形成有序的或可预测的二级或三级结构(例如，发夹环)的rna序列。

72、如本文使用的，“核酶”是指催化rna或rna的催化区。“自切割核酶”是能够催化在核酶序列自身内的核苷酸位点处或在核酶序列自身的末端处发生的切割反应的核酶。

73、如本文使用的，“核酶”是指催化rna或rna的催化区。“自切割核酶”是能够催化在核酶序列自身内的核苷酸位点处或在核酶序列自身的末端处发生的切割反应的核酶。

74、如本文使用的，术语“受试者”是指生物体，如动物、植物、或微生物。在实施例中，该受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物、或两栖动物)。在实施例中，该受试者是人，包括成人和非成人(婴儿和儿童)。在实施例中，该受试者是非人哺乳动物。在实施例中，该受试者是非人哺乳动物，如非人灵长类动物(例如，猴、猿)、有蹄类动物(例如，牛科动物，包括牛、水牛、野牛、绵羊、山羊、和麝牛；猪；骆驼科动物，包括骆驼、美洲驼、和羊驼；鹿，羚羊；和马科动物，包括马和驴)、肉食动物(例如，狗、猫)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、松鼠)、或兔类动物(例如，兔子、野兔)。在实施例中，该受试者是鸟，如以下鸟类分类群的成员：鸡形目(例如鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑)、雁形目(例如鸭、鹅)、古颚下纲(例如鸵鸟、鸸鹋)、鸽形目(例如鸽子、野鸽)、或鹦形目(例如鹦鹉)。在实施例中，该受试者是无脊椎动物，如节肢动物(例如，昆虫、蛛形纲、甲壳动物)、线虫、环节动物、蠕虫、或软体动物。在实施例中，该受试者是无脊椎动物农业有害生物或寄生在无脊椎动物或脊椎动物宿主上的无脊椎动物。在实施例中，该受试者是植物，如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如，针叶树、苏铁、买麻藤类植物、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类、或苔藓植物。在实施例中，该受试者是真核藻类(单细胞或多细胞)。在实施例中，该受试者是具有农业或园艺重要性的植物，如行间作物、生产水果的植物和树木、蔬菜、树木、以及观赏植物(包括观赏花、灌木、树木、地被植物、和草坪草)。

75、植物和植物细胞是任何目的物种(包括双子叶植物和单子叶植物)的植物和植物细胞。目的植物包括行间作物、生产水果的植物和树木、蔬菜、树木、以及观赏植物(包括观赏花、灌木、树木、地被植物、和草坪草)。商业上重要的栽培作物、树木、和植物的实例包括：苜蓿(紫苜蓿(medicago sativa))，杏仁(扁桃(prunus dulcis))，苹果(栽培苹果(malus xdomestica))，杏子(杏(prunus armeniaca)，布里扬松杏(p.brigantine)，东北杏(p.mandshurica)，梅(p.mume)，西伯利亚杏(p.sibirica))，芦笋(asparagus)(芦笋(asparagus officinalis))，香蕉(芭蕉属物种(musa spp.))，大麦(barley)(大麦(hordeum vulgare))，豆类(菜豆属物种(phaseolus spp.))，蓝莓和蔓越莓(越橘属物种(vaccinium spp.))，可可(cocao)(可可(theobroma cacao))，卡诺拉和油菜籽或油菜(欧洲油菜(brassica napus))，波兰卡诺拉(芜青(brassica rapa))以及相关的十字花科蔬菜，包括西兰花，羽衣甘蓝，卷心菜，和萝卜(埃塞俄比亚芥(brassica carinata)、芥菜(b.juncea)、甘蓝(b.oleracea)、甘蓝型油莱(b.napus)、黑芥(b.nigra)、和芜青(b.rapa)、以及这些的杂交体)，康乃馨(香石竹(dianthus caryophyllus))，胡萝卜(胡萝卜(daucuscarota sativus))，木薯(cassava)(木薯(manihot esculentum))，樱桃(欧洲甜樱桃(prunus avium))，鹰嘴豆(chickpea)(鹰嘴豆(cicer arietinum))，菊苣(chicory)(菊苣(cichoriumintybus))，红辣椒和其他辣椒属(capsicum)辣椒(辣椒(capsicum annuum)，尖椒(c.frutescens)，中华辣椒(c.chinense)，绒毛辣椒(c.pubescens)，灯笼辣椒(c.baccatum))，菊花(菊属物种(chrysanthemum spp.))，椰子(coconut)(椰子(cocosnucifera))，咖啡(咖啡属物种(coffea spp.)，包括小粒咖啡(coffea arabica)和中粒咖啡(coffea canephora))，棉花(陆地棉(gossypium hirsutum l.))，豇豆(cowpea)(豇豆(vigna unguiculata)和其他豇豆属物种(vigna spp.))，蚕豆(fava bean)(蚕豆(viciafaba))，黄瓜(cucumber)(黄瓜(cucumis sativus))，红醋栗和醋栗(茶藨子属物种(ribesspp.))，枣(海枣(phoenix dactylifera))，浮萍(浮萍科(lemnoideae))，茄子或矮瓜(茄(solanummelongena))，桉树(桉属物种(eucalyptus spp.))，亚麻(flax)(亚麻(linumusitatissumum l.))，天竺葵(天竺葵属物种(pelargonium spp.))，葡萄柚(grapefruit)(葡萄柚(citrus x paradisi))，葡萄(grape)(葡萄属物种(vitus spp.))，包括酿酒葡萄(酿酒用葡萄(vitus vinifera)及其杂交体)，番石榴(guava)(番石榴(psidiumguajava))，啤酒花(hops)(啤酒花(humulus lupulus))，苎麻和大麻(cannabis)(大麻(cannabis sativa)和大麻属物种(cannabis spp.))，鸢尾花(鸢尾属物种(iris spp.))，柠檬(lemon)(柠檬(citrus limon))，生菜(莴苣(lactuca sativa))，酸橙(柑橘属物种(citrus spp.))，玉米(玉蜀黍(zea mays l.))，芒果(芒果(mangifera indica))，山竹(莽吉柿(garcinia mangostana))，瓜(甜瓜(cucumis melo))，小米(狗尾草属物种(setariaspp.)、稗属物种(echinochloa spp.)、穇属物种(eleusine spp.)、黍属物种(panicumspp.)、狼尾草属物种(pennisetum spp.))，燕麦(oat)(燕麦(avena sativa))，油棕(oilpalm)(油棕(ellis quineensis))，橄榄(木犀榄(olea europaea))，洋葱(onion)(洋葱(allium cepa))和其他葱蒜类植物(葱属物种(allium spp.))，橙(甜橙(citrussinensis))，木瓜(番木瓜(carica papaya))，桃子和油桃(碧桃(prunus persica))，梨(梨属物种(pyrus spp.))，豌豆(pea)(豌豆(pisa sativum))，花生(落花生(arachishypogaea))，牡丹(芍药属物种(paeonia spp.))，矮牵牛(碧冬茄属物种(petunia spp.))，菠萝(凤梨(ananas comosus))，大蕉(芭蕉属物种)，李子(欧洲李(prunus domestica))，圣诞红(一品红(euphorbia pulcherrima))，白杨(杨属物种(populus spp.))，马铃薯(马铃薯(solanum tuberosum))，南瓜(pumpkin)和倭瓜(西葫芦(cucurbita pepo)、笋瓜(c.maximus)、南瓜(c.moschata))，水稻(稻(oryza sativa l.))，玫瑰(蔷薇属物种(rosaspp.))，橡胶(橡胶树(hevea brasiliensis))，黑麦(rye)(黑麦(secale cereale))，红花(safflower)(红花(carthamus tinctorius l))，芝麻籽(芝麻(sesame indium))，高粱(sorghum)(高粱(sorghum bicolor))，大豆(橹豆(glycine max l.))，草莓(strawberry)(草莓属物种(fragaria spp.)，草莓(fragaria x ananassa))，甜菜(sugar beet)(甜菜(beta vulgaris))，甘蔗(甘蔗属物种(saccharum spp.))，向日葵(sunflower)(向日葵(helianthus annuus))，甘薯(sweet potato)(甘薯(ipomoea batatas))，橘子(福橘(citrus tangerina))，茶(茶树(camellia sinensis))，烟草(tobacco)(烟草(nicotianatabacum l.))，番茄(tomato)(番茄(solanum lycopersicum或lycopersiconesculentum))，郁金香(郁金香属物种(tulipa spp.))，核桃(胡桃属物种(juglansspp.l.))，西瓜(watermelon)(西瓜(citrullus lanatus))，小麦(普通小麦(triticumaestivum))，和山药(薯蓣属物种(discorea spp.))。

76、许多无脊椎动物被认为是有害生物，因为它们会破坏对人重要的资源，或在人、非人动物(特别是家畜)、或植物中引起或传播疾病。控制有害生物无脊椎动物的努力通常采用合成的化学物质，这些化学物质本身可能会因其毒性(包括对人和其他非靶标生物体，如有益的无脊椎动物)、缺乏特异性、在环境中的持久性、以及通过食物链转运而具有不希望的影响。

77、损害植物(特别是作为作物种植的驯化植物)的无脊椎农业有害生物包括但不限于节肢动物(例如，昆虫、蛛形纲、多足类)、线虫、扁形动物、和软体动物。重要的农业无脊椎有害生物包括以下昆虫的代表性有害生物：鞘翅目(甲虫)、双翅目(苍蝇)、鳞翅目(蝴蝶、飞蛾)、直翅目(蚱蜢、蝗虫)、缨翅目(蓟马)、和半翅目(椿象)、蛛形纲(如螨虫和蜱)，各种蠕虫(如线虫(蛔虫)和扁形动物(扁虫))，以及软体动物(如蛞蝓和蜗牛)。

78、农业昆虫有害生物的实例包括蚜虫、球蚜(adalgids)、根瘤蚜、潜叶虫、粉虱、毛虫(蝴蝶或蛾幼虫)、水蜡虫、介壳虫、蚱蜢、蝗虫、苍蝇、蓟马、蠼螋、臭虫、跳甲、象鼻虫、螟蛉虫、神枪手(sharpshooter)、根或茎蛀虫、叶蝉、潜叶虫、和蠓。重要的鳞翅目农业有害生物的非限制性特定实例包括，例如，小菜蛾(diamondback moth)(小菜蛾(plutellaxylostella))，各种“螟蛉虫”(例如，棉铃虫属物种(diparopsis spp.)、钻夜蛾属物种(earias spp.)、铃虫属物种(pectinophora spp.)、和铃夜蛾属物种(helicoverpa spp.)，包括玉米穗虫(corn earworm)、谷实夜蛾(helicoverpa zea)、和棉铃虫(棉铃虫(helicoverpa armigera))，欧洲玉米蛀虫(玉米螟(ostrinia nubilalis))，黑色切根虫(小地老虎(agrotis ipsilon))，“粘虫”(例如，草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(spodoptera exigua)、海灰翅夜蛾(spodoptera littoralis)、一星黏虫(pseudaletia unipuncta))，玉米秆蛀虫(普通蛀茎夜蛾(papaipema nebris))，豆白缘切根虫(菜豆白缘切根虫(striacosta albicosta))，舞毒蛾(gypsy moth)(毒蛾属物种(lymatria spp.))，菜青虫(pieris rapae)，红铃麦蛾(pectinophora gossypiella)，小桃翅蛾(synanthedon exitiosa)，南瓜藤透翅蛾(melittia cucurbitae)，苹果小卷蛾(cydiapomonella)，梨小食心虫(grapholita molesta)，印度谷斑螟(plodia interpunctella)，大蜡螟(galleria mellonella)，烟草天蛾(manduca sexta)，番茄天蛾(manducaquinquemaculata)，舞毒蛾(lymantria dispar)，黄毒蛾(euproctis chrysorrhoea)，粉纹夜蛾(trichoplusia ni)，甘蓝夜蛾(mamestra brassicae)，梨豆夜蛾(anticarsiagemmatalis)，大豆尺金夜蛾(pseudoplusia includens)，菜豆小卷蛾(epinotiaaporema)，烟芽夜蛾(heliothis virescens)，三化螟(scripophaga incertulus)，蛀茎夜蛾属物种(sesamia spp.)，buseola fusca，稻纵卷叶螟(cnaphalocrocis medinalis)和二化螟(chilo suppressalis)。重要的鞘翅目(甲虫)农业有害生物的非限制性特定实例包括，例如，马铃薯甲虫(colorado potato beetle)(科罗拉多马铃薯甲虫(leptinotarsadecemlineata))和其他金花虫属物种(leptinotarsa spp.)，例如，伪马铃薯叶甲(l.juncta)(假马铃薯甲虫)、l.haldemani(霍尔德曼(haldeman)绿色马铃薯甲虫)、膜苞菊叶甲(l.lineolata)(菊科灌木叶甲虫)、l.behrensi、l.collinsi、l.defecta、l.heydeni、蒺藜叶甲(l.peninsularis)、柔毛茄叶甲(l.rubiginosa)、胡颓子叶茄叶甲(l.texana)、蒺藜四条叶甲(l.tlascalana)、l.tumamoca、和l.typographica；“玉米根虫”和“黄瓜甲虫”，包括西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(diabrotica virgifera virgifera))、北方玉米根虫(northern corn rootworm)(北方玉米根虫(d.barberi))、南方玉米根虫(十一星叶甲食根亚种(d.undecimpunctata howardi))、葫芦甲虫(南美叶甲(d.speciosa))、带状黄瓜甲虫(带纹黄瓜萤叶甲(d.balteata))、条纹黄瓜甲虫(带纹条叶甲(acalymma vittatum))、和西部条纹黄瓜甲虫(西部黄瓜条叶甲(a.trivittatum))；“跳甲”，例如，蚤凹胫跳甲(chaetocnema pulicaria)、条跳甲属物种(phyllotreta spp.)、和蚤跳甲属物种(psylliodes spp.)；“玉米种甲虫”，例如，玉米小蝼甲(stenolophus lecontei)和玉米籽步甲(clivinia impressifrons)；谷类叶甲虫(橙足负泥虫(oulema melanopus))；日本甲虫(日本弧丽金龟(popillia japonica))和其他“白蛴螬(white grubs)”，例如，鳃角金龟属物种(phyllophaga spp.)、方头甲属物种(cyclocephala spp.)；谷斑皮蠹(khaprabeetle)(谷斑皮蠹(trogoderma granarium))；棕榈核小蠹(date stone beetle)(棕榈核小蠹(coccotrypes dactyliperda))；棉铃象鼻虫(boll weevil)(棉铃象鼻虫(anthonomusgrandis grandis))；蛀茎虫(dectes stem borer)(蛀茎虫(dectes texanus))；“线虫”“磕头虫”，例如，梳爪叩头虫属物种(melanotus spp.)、小麦叩甲(agriotes mancus)、和甜菜叩甲(limonius dubitans)。重要的半翅目(椿象)农业有害生物的非限制性特定实例包括，例如，褐纹蝽(茶翅蝽(halyomorpha halys))、绿蝽象(green stinkbug)(绿蝽(chinaviahilaris))；象甲，例如，玉米长喙象(sphenophorus maidis)；吹沫虫，例如，牧场沫蝉(meadow spittlebug)(长沫蝉(philaenus spumarius))；叶蝉，例如，马铃薯叶蝉(苹果小绿叶蝉(empoasca fabae))、甜菜叶蝉(beet leafhopper)(甜菜叶蝉(circulifertenellus)、蓝绿神枪手(blue-green sharpshooter)(蓝绿叶蝉(graphocephalaatropunctata))、玻璃翅神枪手(翅尖头叶蝉(homalodisca vitripennis))、玉米叶蝉(maize leafhopper)(玉米叶蝉(cicadulina mbila)、两斑叶蝉(two-spottedleafhopper)(双斑夜蛘(sophonia rufofascia))、普通褐叶蝉(南斑叶蝉(orosiusorientalis))、水稻绿叶蝉(黑尾叶蝉属物种(nephotettix spp.))、和白苹果叶蝉(苹白小叶蝉(typhlocyba pomaria))；蚜虫(例如，缢管蚜属物种(rhopalosiphum spp.)、蚜虫属物种(aphis spp.)、瘤蚜属物种(myzus spp.))，葡萄根瘤蚜(grape phylloxera)(葡萄根瘤蚜(daktulosphaira vitifoliae))和木虱，例如，亚洲柑橘木虱(柑桔木虱(diaphorinacitri))、非洲柑橘木虱(african citrus psyllid)(柑桔木虱(trioza erytreae))、马铃薯/番茄木虱(番茄木虱(bactericera cockerelli))。重要农业有害生物的其他实例包括蓟马(例如，西方花蓟马(frankliniella occidentalis)、麦花蓟马(f.tritici)、唐菖蒲简蓟马(thrips simplex)、棕榈蓟马(t.palmi))；双翅目的成员，包括地种蝇属物种(deliaspp.)、果蝇(例如，铃木氏果蝇(drosophila suzukii)和其他果蝇属物种(drosophilaspp.)、地中海实蝇(ceratitis capitata)、果实蝇属物种(bactrocera spp.))、潜叶虫(斑潜蝇属物种(liriomyza spp.))和蠓(例如，黑森瘿蚊(mayetiola destructor))。

79、造成农业损害的其他无脊椎动物包括以植物为食的螨虫，例如，两斑螨虫或红蜘蛛螨虫(二斑叶螨(tetranychus urticae))和云杉蜘蛛螨虫(针叶小爪螨(oligonychusunungui))；各种线虫或蛔虫，例如，根结线虫属物种(meloidogyne spp.)，包括南方根结线虫(m.incognita)(南方根结)、象耳豆根结线虫(m.enterlobii)(番石榴根结)、爪哇根结线虫(m.javanica)(爪哇根结)、北方根结线虫(m.hapla)(北方根结)、和花生根结线虫(m.arenaria)(花生根结)，长针线虫属物种(longidorus spp.)，滑刃线虫属物种(aphelenchoides spp.)，茎线虫属物种(ditylenchus spp.)，马铃薯金线虫(globoderarostochiensis)和其他球孢囊线虫属物种(globodera spp.)，真珠线虫属物种(nacobbusspp.)，异皮线虫属物种(heterodera spp.)，松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)和其他伞滑刃线虫属物种(bursaphelenchus spp.)，短体线虫属物种(pratylenchus spp.)，毛刺线虫属物种(trichodorus spp.)，标记剑线虫(xiphinema index)，异尾剑线虫(xiphinema diversicaudatum)和其他剑线虫属物种(xiphinema spp.)；以及蜗牛和蛞蝓(例如，颈蛞蝓属物种(deroceras spp.)、褐色蛞蝓(vaginulus plebius)、和veronicaleydigi)。

80、有害生物无脊椎动物还包括破坏人造结构或食品储藏、或以其他方式造成滋扰的那些，例如，干木和地下白蚁、木蚁、象鼻虫(例如，三齿豆象属物种(acanthoscelidesspp.)、瘤背豆象属物种(callosobruchus spp.)、象鼻属物种(sitophilus spp.))、面粉甲虫(赤拟谷盗(tribolium castaneum)、杂拟谷盗(tribolium confusum))和其他甲虫(例如，药材甲(stegobium paniceum)、谷斑皮蠹、锯谷盗属物种(oryzaephilus spp.))、飞蛾(例如大蜡螟，其破坏蜂箱；印度谷斑螟(plodia interpunctella)，地中海粉螟(ephestiakuehniella)，谷蛾属物种(tinea spp.)，幕谷蛾属物种(tineola spp.))、蠹虫、和螨虫(例如，粗脚粉螨(acarus siro)、粉尘螨(glycophagus destructor)。

81、许多无脊椎动物被认为是人或兽的有害生物(如叮咬或寄生于人或其他动物的无脊椎动物)，并且许多是致病微生物(例如，细菌、病毒)的载体。这些的实例包括双翅目，如叮咬苍蝇和蠓(例如，白蛉属物种(phlebotomus spp.)、罗蛉属物种(lutzomyia spp.)、虻属物种(tabanus spp.)、斑虻属物种(chrysops spp.)、麻虻属物种(haematopota spp.)、蚋属物种(simulium spp.))和绿头苍蝇(螺旋锥蝇(screwworm flies))(例如，次生锥蝇(cochliomyia macellaria)、美洲锥蝇(c.hominivorax)、c.aldrichi和c.minima(极小锥蝇)；还有红颜金蝇(chrysomya rufifacies)和大头金蝇(chrysomya megacephala)、采采蝇(舌蝇属物种(glossina spp.))、肤蝇(人肤蝇(dermatobia hominis)、皮蝇属物种(dermatobia spp.))；蚊子(例如，伊蚊属物种(aedes spp.)、按蚊属物种(anophelesspp.)、库蚊属物种(culex spp.)、脉毛蚊属物种(culiseta spp.))；臭虫(例如，温带臭虫(cimex lectularius)、热带臭虫(cimex hemipterus))和“接吻虫”(锥猎蝽属物种(triatoma spp.))；昆虫虱目(phthiraptera)(吸虱和嚼虱，例如，人虱(pediculushumanus)、耻阴虱(pthirus pubis))和蚤目(siphonaptera)(跳蚤，例如穿皮潜蚤(tungapenetrans))的成员。寄生蛛形纲也包括重要的疾病载体；实例包括蜱(例如，肩突硬蜱(ixodes scapularis)、太平洋硬蜱(ixodes pacificus)、蓖子硬蜱(ixodes ricinus)、ixodes cookie、美洲花蜱(amblyomma americanum)、海湾花蜱(amblyomma maculatum)、变异革蜱(dermacentor variabilis)、安氏革蜱(dermacentor andersoni)、白纹革蜱(dermacentor albipictus)、血红扇头蜱(rhipicephalus sanguineus)、微小扇头蜱(rhipicephalus microplus)、具环牛蜱(rhipicephalus annulatus)、长角血蜱(haemaphysalis longicornis)、和璃眼蜱属物种(hyalomma spp.))和螨虫，这些螨虫包括疥螨(人疥螨(sarcoptes scabiei)和其他疥螨属物种(sarcoptes spp.))、马痒螨(痒螨属物种(psoroptes spp.))、恙螨(阿氏真恙螨(trombicula alfreddugesi)、秋恙螨(秋恙螨))、蠕形螨(毛囊蠕形螨(demodex folliculorum)、皮脂蠕形螨(demodex brevis)、犬蠕形螨(demodex canis))、蜂螨(例如，狄斯瓦蜂螨(varroa destructor)、大蜂螨(varroajacobosoni)和其他蜂螨属物种(varroa spp.))、气管螨(武氏蜂盾螨(acarapis woodi))和厉螨属物种(tropilaelaps spp.)。可以感染人和/或非人动物的寄生虫包括外寄生虫(如水蛭(环节动物的一种类型))和内寄生虫，统称为“蠕虫”，其感染消化道、皮肤、肌肉、或其他组织或器官。蠕虫包括环节动物门(环形虫或节肢虫)、扁形动物门(扁虫，例如绦虫、吸虫)、线虫动物门(蛔虫)、和棘头动物门(acanthocephala)(棘头虫)的成员。寄生线虫的实例包括人蛔虫(ascaris lumbricoides)、蛔虫属物种(ascaris spp.)、副蛔属物种(parascaris spp.)、贝蛔属物种(baylisascaris spp.)、马来丝虫(brugia malayi)、帝纹丝虫(brugia timori)、班氏丝虫(wuchereria bancrofti)、罗阿丝虫(loa loa)、卷尾丝虫(mansonella streptocerca)、奥氏曼森线虫(mansonella ozzardi)、常现丝虫(mansonella perstans)、盘尾丝虫(onchocerca volvulus)、犬恶丝虫(dirofilariaimmitis)和其他恶丝虫属物种(dirofilaria spp.)、麦地那龙线虫(dracunculusmedinensis)、十二指肠钩虫(ancylostoma duodenale)、锡兰钩口线虫(ancyclostomacelanicum)、和其他钩虫属物种(ancylostoma spp.)、美洲板口线虫(necatoramericanus)和其他板口线虫属物种(necator spp.)、管圆属物种(angriostrongylusspp.)、狭头刺口钩虫(uncinaria stenocephala)、牛仰口线虫(bunostomumphlebotomum)、蠕形住肠蛲虫(enterobius vermicularis)、格氏蛲虫(enterobiusgregorii)和其他蛲虫属物种(enterobius spp.)、粪类圆线虫(strongyloidesstercoralis)、福氏类圆线虫(strongyloides fuelleborni)、乳突类圆线虫(strongyloides papillosus)、兰氏类圆线虫(strongyloides ransomi)和其他类圆线虫属物种(strongyloides spp.)、加利福尼亚吸吮线虫(thelazia californiensis)、结膜吸吮线虫(thelazia callipaeda)、毛首鞭虫(trichuris trichiura)、犬鞭虫(trichurisvulpis)、旋毛虫(trichinella spiralis)、布氏旋毛虫(trichinella britovi)、纳氏旋毛虫(trichinella nelson)、本地毛形线虫(trichinella nativa)、犬弓蛔虫(toxocaracanis)、猫蛔虫(toxocara cati)、狮弓蛔虫(toxascaris leonina)、班氏丝虫(wuchereriabancrofti)、和捻转血矛线虫(haemonchus contortus)。寄生扁形动物的实例包括牛肉绦虫(taenia saginata)、猪肉绦虫(taenia solium)、多头绦虫(taenia multiceps)、阔节裂头绦虫(diphyllobothrium latum)、细粒棘球绦虫(echinococcus granulosus)、多房棘球绦虫(echinococcus multilocularis)、伏氏棘球绦虫(echinococcus vogeli)、少节棘球绦虫(echinococcus oligarthrus)、短膜壳绦虫(hymenolepis nana)、缩小膜壳绦虫(hymenolepis diminuta)、欧猥迭宫绦虫(spirometra erinaceieuropaei)、埃及血吸虫(schistosoma haematobium)、曼氏血吸虫(schistosoma mansoni)、日本血吸虫(schistosoma japonicum)、间插血吸虫(schistosoma intercalatum)、湄公血吸虫(schistosoma mekongi)、布氏姜片虫(fasciolopis buski)、异形异形吸虫(heterophyesheterophyes)、肝片吸虫(fasciola hepatica)、大片吸虫(fasciola gigantica)、华支睾吸虫(clonorchis sinensis)、clonorchis vivirrini、支双腔吸虫(dicrocoeliumdendriticum)、拟人腹盘吸虫(gastrodiscoides hominis)、横川后殖吸虫(metagonimusyokogawai)、结合次睾吸虫(metorchis conjunctus)、麝猫后睾吸虫(opisthorchisviverrine)、猫后睾吸虫(opisthorchis felineus)、卫氏并殖吸虫(paragonimuswestermani)、非洲并殖吸虫(paragonimus africanus)、并殖吸虫属物种(paragonimusspp.)、多刺棘口吸虫(echinostoma echinatum)、和regenti毛毕吸虫(trichobilharziaregenti)。

82、内寄生的原生动物无脊椎动物包括棘阿米巴属物种(axanthamoeba spp.)、巴氏阿米巴(balamuthia mandrillaris)、分歧巴贝斯虫(babesia divergens)、双芽巴贝斯虫(babesia bigemina)、马巴贝斯虫(babesia equi)、微小巴贝斯虫(babesia microfti)、邓肯巴贝斯虫(babesia duncani)、结肠小袋纤毛虫(balantidium coli)、芽囊原虫属物种(blastocystis spp.)、隐孢子虫属物种(cryptosporidium spp.)、卡耶塔环孢子虫(cyclospora cayetanensis)、脆双核阿米巴(dientamoeba fragili)、溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)、蓝氏贾第鞭毛虫(giardia lamblia)、贝氏等孢球虫(isosporabelli)、利什曼虫属物种(leishmania spp.)、福氏耐格里阿米巴(naegleria fowleri)、恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、间日疟原虫(plasmodium vivax)、三日疟原虫(plasmodium malariae)、卵形疟原虫柯氏亚种(plasmodium ovale curtisi)、卵形疟原虫沃氏亚种(plasmodium ovale wallikeri)、诺氏疟原虫(plasmodium knowlesi)、西伯氏鼻孢子虫(rhinosporidium seeberi)、肉孢子虫属物种(sarcosystis spp.)、刚地弓形虫(toxoplasma gondii)、阴道毛滴虫(trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(trypanosomabrucei)、克氏锥虫(trypanosoma cruzi)。

83、如本文使用的，术语“治疗(treat或treating)”是指对受试者的疾病或障碍(例如，感染性疾病、癌症、中毒、或过敏反应)的预防性或治疗性治疗。治疗的效果可以包括如与没有治疗性治疗的情况下该疾病或障碍的状态和/或病症相比，逆转、减轻、降低疾病的严重程度，治愈疾病，抑制疾病的进展，降低该疾病、或该疾病或障碍的一种或多种症状或表现的复发的可能性，稳定(即，不恶化)该疾病或障碍的状态，和/或预防该疾病或障碍的传播。实施例包括治疗植物以控制由无脊椎动物有害生物或微生物(例如，细菌、真菌、卵菌、或病毒)病原体引起或与之相关的疾病或不利病症。实施例包括治疗植物以增加植物的先天防御或免疫能力以耐受有害生物或病原体压力。

84、如本文使用的，术语“终止元件”是终止环状或线性多核糖核苷酸中编码序列的翻译的部分，如核酸序列。

85、如本文使用的，术语“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白或肽的转录物产生的蛋白质或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统(例如像真核细胞的真核系统)中。

86、如本文使用的，术语“翻译起始序列”是在环状或线性多核糖核苷酸中起始编码序列的翻译的核酸序列。

87、如本文使用的，术语“治疗性多肽”是指当向受试者施用或在受试者中表达时提供一些治疗性益处的多肽。在实施例中，通过向受试者施用治疗性肽或通过在受试者中表达治疗性多肽，将治疗性多肽用于治疗或预防受试者的疾病、障碍、或病症。在替代性的实施例中，使治疗性多肽在细胞中表达，并且向受试者施用该细胞以提供治疗性益处。

88、如本文使用的，“载体”意指一段dna，它是合成的(例如，使用pcr)，或取自外来dna片段可以或已经插入其中用于克隆和/或表达目的的病毒、质粒、或高等生物体的细胞。在一些实施例中，载体可以稳定地维持在生物体中。载体可以包括例如复制的起点、可选择标志物或报告基因，如抗生素抗性或gfp、和/或多克隆位点(mcs)。该术语包括线性dna片段(例如，pcr产物、线性化质粒片段)、质粒载体、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)等。在一个实施例中，本文提供的载体包括多克隆位点(mcs)。在另一实施例中，本文提供的载体不包括mcs。

89、从以下详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。