半胱氨酸工程化抗体构建体、偶联物及使用方法与流程

本公开涉及抗体领域，尤其涉及被工程化为包括一个或多个半胱氨酸插入突变的抗体，以及包含这些抗体和活性剂的偶联物。

背景技术：

1、抗体药物偶联物(adc)代表了一类相对较新且有前途的治疗剂。adc通常由单克隆抗体经由接头连接到小分子治疗剂(“药物”)而构成。药物抗体比率(dar)和药物偶联的特定位点可能影响adc的稳定性和暴露(hamblett等人，2004,clin.cancer res.,10(20):7063-7070；shen等人，2012,nature biotechnology,30:184-189)。通过经由天然半胱氨酸或赖氨酸残基进行偶联来生成adc的传统方法通常产生在药物载量和药物偶联两方面不均匀的偶联物混合物，这是抗体稳定性、特异性、体内分布、药代动力学和/或疗效中的一者或多者可能出现缺陷的原因。

2、lyons首先在标记抗体的背景下描述了出于位点特异性偶联的目的，用半胱氨酸残基替换抗体中的天然氨基酸(lyons,et al.,1990,protein eng des sel.,3(8):703-708)。随后描述了在抗体中的工程化半胱氨酸残基处进行位点特异性药物偶联，以解决不均匀性问题(thiomabtm)(junutula等人，2008,nat biotechnol.,26:925-932；vollmar等人，2017,bioconjug chem,28(10):2538-2548；ohri等人，2018,bioconjug chem.,29(2):473–485)。还描述了定点诱变掺入半胱氨酸残基的其他实例(例如，sussman等人，2018,protein eng des sel.,31(2):47-54)。

3、还报道了涉及插入半胱氨酸残基而不是用半胱氨酸残基取代天然氨基酸的相关策略(dimasi等人，2017,mol.pharmaceutics,14(5):1501-1516；美国专利申请公开号us2018/0169255)。在先前报道的thiomabtm半胱氨酸取代位置之一的位点(s239c)之后插入半胱氨酸残基，称为c239i，这应用于medi2228(一种临床阶段adc)中。c239i插入导致fcγr结合与抗体依赖性细胞毒性(adcc)的消除。已经描述过这些功能变化的结构基础(gallagher等人，2019,pharmaceutics,11:546)。还已经描述过其他半胱氨酸插入方法(美国专利申请公开号us 2020/0129635和国际专利申请公开号wo 2018/233572)。

4、提供该背景信息的目的在于使申请人相信的已知信息成为与本公开可能相关的信息。不一定旨在承认，也不应该解释为，任何前述信息构成了针对所要求保护的发明的现有技术。

技术实现思路

1、本文描述了半胱氨酸工程化抗体构建体、偶联物及使用方法。

2、在一个方面，本公开涉及一种半胱氨酸工程化抗体构建体，其包含vh结构域、vh结构域和vl结构域、fc区，或它们的组合，fc区包含ch2结构域和/或ch3结构域，该抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：(a)在vl结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；(b)在vl结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；(c)在cl结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；(d)在cl结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；(e)在cl结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；(f)在vh结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；(g)在ch1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；(h)在ch2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；(i)在ch2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及(j)在ch2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，其中vl、cl、vh和ch1结构域中的氨基酸编号是kabat编号，ch2结构域中的氨基酸编号是eu编号，并且其中抗体构建体基于免疫球蛋白g(igg)。

3、在另一个方面，本公开涉及一种偶联物，其包含如本文所公开的任一个实施方案中所述的半胱氨酸工程化抗体构建体，以及与一个或多个插入的半胱氨酸残基中的每一者偶联的一种或多种活性剂。

4、在另一个方面，本公开涉及具有式(i)的偶联物：

5、a-(l-(d)q)p(i)

6、其中a是半胱氨酸工程化抗体构建体；l是接头；d是活性剂；q是介于1与4之间的整数，p是介于1与8之间的整数，其中半胱氨酸工程化抗体构建体包含vh结构域、vh结构域和vl结构域、fc区，或它们的组合，fc区包含ch2结构域和/或ch3结构域，并且其中半胱氨酸工程化抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：(a)在所述vl结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；(b)在所述vl结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；(c)在cl结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；(d)在所述cl结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；(e)在所述cl结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；(f)在所述vh结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；(g)在ch1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；(h)在所述ch2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；(i)在所述ch2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及(j)在所述ch2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，其中vl、cl、vh和ch1结构域中的氨基酸编号是kabat编号，ch2结构域中的氨基酸编号是eu编号，其中半胱氨酸工程化抗体构建体基于免疫球蛋白g(igg)，并且其中每个d经由l与插入的半胱氨酸残基连接。

7、在另一个方面，本公开涉及一种组合物，其包含如本文所公开的任一个实施方案中所述的偶联物，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。

8、在另一个方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的如本文所述的偶联物，其中该偶联物所包含的活性剂是治疗剂。

9、在另一个方面，本公开涉及一种如本文所述用于治疗的偶联物，其中该偶联物所包含的活性剂是治疗剂。

10、在另一个方面，本公开涉及如本文所述偶联物在制造用于治疗有需要的受试者的药物中的用途，其中该偶联物所包含的活性剂是治疗剂。

11、在另一个方面，本公开涉及一种制备如本文所公开的任一个实施方案中所述的偶联物的方法，其包括将半胱氨酸工程化抗体构建体置于还原条件下，使得一个或多个插入的半胱氨酸残基的硫醇基团被还原，然后使硫醇反应性接头-活性剂与抗体构建体在允许接头与还原的硫醇之间形成键的条件下反应。

12、在另一个方面，本公开涉及一种制备具有预先确定的药物抗体比率(dar)的抗体-药物偶联物的方法，该方法包括：(i)提供半胱氨酸工程化抗体构建体，其包含vh结构域、vh结构域和vl结构域、fc区，或它们的组合，fc区包含ch2结构域和/或ch3结构域，并且该抗体构建体包含一个或多个选自下列项的半胱氨酸插入突变：(a)在所述vl结构域中的第39位与第40位之间插入半胱氨酸残基；(b)在所述vl结构域中的第40位与第41位之间插入半胱氨酸残基；(c)在cl结构域中的第126位与第127位之间插入半胱氨酸残基；(d)在所述cl结构域中的第148位与第149位之间插入半胱氨酸残基；(e)在所述cl结构域中的第149位与第150位之间插入半胱氨酸残基；(f)在所述vh结构域中的第9位与第10位之间插入半胱氨酸残基；(g)在ch1结构域中的第169位与第170位之间插入半胱氨酸残基；(h)在所述ch2结构域中的第237位与第238位之间插入半胱氨酸残基；(i)在所述ch2结构域中的第295位与第296位之间插入半胱氨酸残基，以及(j)在所述ch2结构域中的第299位与第300位之间插入半胱氨酸残基，然后(ii)使半胱氨酸工程化抗体构建体与药物-接头反应，以提供抗体-药物偶联物；其中预先确定的dar是1、2、3、4、5、6、7或8，并且半胱氨酸工程化抗体构建体包含与预先确定的dar相同数目的半胱氨酸插入突变，其中vl、cl、vh和ch1结构域中的氨基酸编号是kabat编号，ch2结构域中的氨基酸编号是eu编号，并且其中半胱氨酸工程化抗体构建体基于免疫球蛋白g(igg)。

13、在另一个方面，本公开涉及一种多核苷酸或一组多核苷酸，其编码如本文所公开的任一个实施方案中所述的半胱氨酸工程化抗体构建体。

14、在另一个方面，本公开涉及一种包含一个或多个多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码如本文所公开的任一个实施方案中所述的半胱氨酸工程化抗体构建体。

15、在另一个方面，本公开涉及一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码如本文所公开的任一个实施方案中所述的半胱氨酸工程化抗体构建体。